قياس نشاط Helicase للبروتين المستهدف باستخدام دوبلكس الحمض النووي الريبي المسمى بالبيوتين

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Yu ، L. et al. ، فحوصات الكيمياء الحيوية في المختبر باستخدام ملصقات البيوتين لدراسة تفاعلات البروتين والحمض النووي. J. Vis. إكسب. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح الإجراء لتحديد نشاط الهليكاز للبروتين المستهدف لفك ركيزة dsRNA المسماة بالبيوتين. تم تحديد نشاط الإنزيم من خلال تحليل تحول الحركة الكهربية ، متبوعا بفحص التلألؤ الكيميائي باستخدام الستربتافيدين المترافق بالإنزيم الكيميائي.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير البروتين

1. بنيات تعبير MOV10
   1. إنشاء إنشاءات تعبير (كدنا) لتشفير الماوس MOV10.
      1. قم بإعداد تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لكل جزء. امزج 1 ميكرولتر من الحمض النووي (كدنا) للفأر (من خصية الفأر C57BL / 6) ، و 1 ميكرولتر من dNTP ، و 2 ميكرولتر من 10 ميكرومتر التمهيدي الأمامي ، و 2 ميكرولتر من التمهيدي العكسي 10 ميكرومتر ، و 1 ميكرولتر من بوليميراز الحمض النووي ، و 25 ميكرولتر من المخزن المؤقت 2x PCR ، و 18 ميكرولتر من H₂O المقطر المزدوج (ddH₂O) في حجم نهائي قدره 50 ميكرولتر
         ملاحظه: يتم سرد البادئات لتضخيم شظايا الجينات Mov10 في الجدول 1.
      2. قم بإجراء تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام البرامج التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، و 35 دورة تسخين عند 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، والتلدين عند 64 درجة مئوية لمدة 15 ثانية ، والتمديد عند 72 درجة مئوية لمدة 20 ثانية (دقيقتان لتمديد MOV10 كامل الطول) ، والتمديد النهائي عند 68 درجة مئوية لمدة 7 دقائق.
   2. قم بتحليل الحمض النووي المضخم ل PCR عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام ، وقم بقص الشريط بالحجم المطلوب من الجل بسرعة تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية ، ووضعه في أنبوب الطرد المركزي. < / > ملاحظه: حجم المنتج المتوقع المرئي على جل الاغاروز ل MOV10 هو 3015 نقطة أساس.
   3. قم بتنقية الحمض النووي لتفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة استخراج الجل باتباع بروتوكول الشركة المصنعة.
      1. أضف حجما متساويا من المخزن المؤقت المذاب في أنبوب الطرد المركزي من الخطوة 1.1.2 وقم بإذابة الجل في حمام مائي 50-55 درجة مئوية لمدة 5-10 دقائق ، مما يضمن ذوبان قطع الجل تماما. جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة لجمع أي قطرات من جدار الأنبوب. < / > ملاحظه: تركيز الكتلة / الحجم للهلام والمخزن المؤقت الذائب هو 1 مجم / ميكرولتر.
      2. ضع عمود الامتزاز في أنبوب التجميع ، وانقل المحلول الذي يحتوي على جزء الهلام المذاب إلى عمود الامتزاز ، وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة دقيقتين.
      3. تخلص من المرشح في الجزء السفلي من أنابيب التجميع. أضف 600 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى العمود ، وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة دقيقة واحدة ، وتخلص من المرشح.
      4. كرر الخطوة 1.1.3.3 مرة واحدة.
      5. ضع العمود مرة أخرى في أنبوب التجميع ، وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة دقيقتين لإزالة كل مخزن الغسيل المتبقي.
      6. ضع عمود الامتزاز في أنبوب طرد مركزي معقم سعة 1.5 مل ، وأضف 50 ميكرولتر من ddH₂O إلى مركز عمود الامتزاز ، وجهاز الطرد المركزي عند 12,000 × جم لمدة 1 دقيقة. قم بقياس تركيز الحمض النووي للشطف باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
   4. تقييد هضم البلازميدات
      1. هضم متجه pRK5 مع BamHI و XhoI عن طريق خلط 4 ميكروغرام من ناقل pRK5 ، و 5 ميكرولتر من المخزن المؤقت للهضم 10x ، و 1 ميكرولتر من BamHI ، و 1 ميكرولتر من XhoI و ddH₂O إلى حجم تفاعل نهائي يبلغ 50 ميكرولتر. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
   5. قم بتحليل الحمض النووي المتجه عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام ، وقم بقص نطاق الحجم المطلوب من الجل بسرعة باستخدام مشرط تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية وضعه في أنبوب الطرد المركزي.
   6. قم بتنقية الحمض النووي الناقل باستخدام مجموعة استخراج الجل ك 1.1.3 باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
   7. قم بإعداد تفاعل ربط مؤتلف قياسي من خلال الجمع بين 0.03 مللي مول من المتجه الخطي ، و 0.06 مللي مول من جزء (كدنا) ، و 2 ميكرولتر من الليغاز ، و 4 ميكرولتر من 5x ligase buffer و ddH₂O في حجم تفاعل نهائي يبلغ 10 ميكرولتر
      ملاحظه: استنساخ MOV10 في متجه pRK5.
   8. احتضن الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، ثم قم بتبريد التفاعل على الفور لمدة 5 دقائق على الثلج. تحويل البلازميدات المؤتلفة MOV10 إلى بكتيريا DH5α.
      ملاحظه: تحقق من جميع التركيبات المؤتلفة عن طريق تسلسل Sanger.
   9. تحضير مخزونات الجلسرين من المزارع البكتيرية التي تحتوي على بلازميدات مؤتلفة تم التحقق منها عن طريق إضافة حجم متساو من 50٪ من الجلسرين إلى المزارع السائلة ، وتخزينها عند -80 درجة مئوية.
      ملاحظه: لكل تجربة لاحقة ، قم بإخراج البكتيريا من مخزون الجلسرين على صفيحة أجار جديدة واستخدم مستعمرة واحدة للتمدد كما هو موضح في الخطوة 1.2.
2. مستخلصات بروتين MOV10 من خلايا HEK293T
   1. تعبر بشكل عابر عن بروتينات MOV10 في الخلايا HEK293T المستنبتة.
      1. تحضير بلازميد MOV10-pRK5 بتركيز >500 نانوغرام / ميكرولتر.
      البذور
      2. HEK293T الخلايا في أطباق 15 سم. عندما تصل كثافة الخلية إلى ~ 70٪ -90٪ ، استبدل وسط زراعة الخلايا بوسط النسر المعدل الطازج (DMEM) الذي يحتوي على 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
      3. لتعداء واحد ، قم بتخفيف 60 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد MOV10-pRK5 في 3 مل من وسط المصل المخفض ، ثم أضف 120 ميكرولتر من كاشف محسن التعدي ، واخلطه جيدا.
      4. في أنبوب منفصل ، قم بتخفيف 90 ميكرولتر من كاشف التعدي مع 3 مل من وسط المصل المختزل (بدون البنسلين - الستربتومايسين) واخلطه جيدا.
      5. أضف الحمض النووي المخفف إلى كل أنبوب من كاشف التعداء المخفف. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
      6. أضف خليط التعداء إلى مزرعة الخلايا ، وخلايا الزراعة لمدة ~ 36-48 ساعة.
   2. بعد 36-48 ساعة ، اجمع الخلايا من كل لوحة في أنبوب سعة 50 مل. جهاز طرد مركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اغسل كل حبيبات ب 10 مل من PBS المثلج ، واجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   3. أعد تعليق الحبيبات في 3 مل من المخزن المؤقت لتحلل الخلايا الذي يحتوي على كوكتيل مثبط للبروتياز خال من حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA). احتضن لمدة 30 دقيقة على الثلج. جهاز الطرد المركزي للمحللة عند 20,000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
   4. أضف 100 ميكرولتر من الخرز المغناطيسي المضاد ل FLAG لكل طبق من الخلايا في أنبوب سعة 1.5 مل.
   5. اغسل الخرزات المغناطيسية 2x باستخدام المخزن المؤقت K150 (50 ملي HEPES عند درجة الحموضة 7.5 ، 150 ملي مولار KoAc ، 1 ملي مولار DTT ، 0.1٪ NP-40).
      1. أعد تعليق الخرزات المغناطيسية في 1 مل من المخزن المؤقت K150 المثلج.
      2. احتضان الخرزات المغناطيسية لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية مع دوران لطيف وحبيبات الخرز المغناطيسي بمساعدة مغناطيس. قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها.
   6. أضف الخرزات المغناطيسية إلى المادة الطافية المحللة للخلية من الخطوة 1.3.3 واحتضانها عند 4 درجات مئوية لمدة ساعتين.
   7. اغسل الخرزات المغناطيسية المرتبطة بالبروتين 3x باستخدام المخزن المؤقت K150 ، ثم 2x مع K150 التي تحتوي على 250 ملي كلوريد الصوديوم ، ثم 3x مع المخزن المؤقت K150 ك 1.3.5.
   8. أعد تعليق الخرزات في 300 ميكرولتر من محلول الشطف FLAG (100 ملي كلوريد الصوديوم ، 20 ملي مولار Tris-HCl عند درجة الحموضة 7.5 ، 5 ملي مولار MgCl₂ ، 10٪ جلسرين) ، أضف ببتيد FLAG إلى التركيز النهائي البالغ 0.5 ميكروغرام / ميكرولتر ، واحتضانه بالخرز على دوار عند 4 درجات مئوية لمدة ساعة واحدة ، ثم قم بتكسير الخرز المغناطيسي بمساعدة مغناطيس.
   9. اجمع المادة الطافية التي تحتوي على بروتينات MOV10 المملوثة ، وحدد تركيزها ، وخزنها عند -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تحضير الحمض النووي

1. قم بشراء قليل النوكليوتيدات الحمض النووي والحمض النووي الريبي (oligos) مع أو بدون ملصقات البيوتين من مصدر مناسب. قم بتخفيف كل oligo في ddH₂O الخالي من RNase إلى 20 ميكرومتر واحتفظ به عند -80 درجة مئوية للاستخدام في المستقبل.
   ملاحظه: يتم سرد تسلسل oligo لركائز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 2.
2. قم بإعداد الخليط التالي لتفاعل التلدين الحمض النووي الريبي المزدوج الشريطة (dsRNA) لمقايسة نشاط الهليكاز MOV10: امزج 60 ملي مولار N-2-hydroxyethylpiperazine-N-ethane-sulphonic acid (HEPES) عند درجة الحموضة 7.5 ، 6 ملي مولار KCl ، 0.2 ملي مولار MgCl₂ ، و ddH₂O الخالي من RNase في حجم تفاعل نهائي يبلغ 20 ميكرولتر.
صلب
3. الحمض النووي الريبي oligos لتشكيل الحمض النووي الريبي مزدوج عن طريق تسخين خليط من الخيط العلوي المسمى بالبيوتين (2 ميكرومتر ، التركيز النهائي) و 1.5 ضعف من الخيط السفلي التكميلي غير المسمى في مخزن التلدين (الخطوة 2.2) عند 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ، ثم تبريده ببطء إلى درجة حرارة الغرفة (RT).

< ص الفئة = "jove_title" >3. في المختبر المقايسات الكيميائية الحيوية

1. EMSA والتفاعلات الأنزيمية
   1. بالنسبة لمقايسة نشاط الهليكاز MOV10 ، امزج 50 ملي مولار Tris-HCl عند درجة الحموضة 7.5 ، 20 ملي مولار KoAc ، 2 ملي مولار MgCl₂ ، 0.01٪ NP-40 ، 1 ملي مولار DTT ، 2 U / ميكرولتر مثبط RNase ، 10 نانومتر ركيزة الحمض النووي الريبي المسمى بالبيوتين ، 2 ملي مولار أدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP) ، مصيدة 100 نانومتر من الحمض النووي الريبي ، و 20 نانوغرام من بروتين MOV10 و ddH₂O في حجم تفاعل نهائي يبلغ 20 ميكرولتر. احتضان خليط التفاعل عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، 30 دقيقة و 60 دقيقة. أضف المخزن المؤقت 5x stop لإيقاف التفاعل.
      ملاحظه: مصيدة الحمض النووي الريبي ، أوليغو غير مصنف بالبيوتين مع تسلسل ، تكامل مع oligo المسمى ، مما يمنع dsRNA غير المجروح من التلدين مرة أخرى.
2. المواد الهلامية بولي أكريلاميد
   1. اغسل ألواح الجل (16 سم × 16 سم) وأمشاط 1.5 مم. قم بتجميع وحدات الرحلان الكهربائي للهلام.
   2. لتحضير جل بولي أكريلاميد أصلي بنسبة 10٪ ، اخلطي 14 مل من ddH₂O ، و 1.25 مل من 10x Tris-Boric acid-EDTA (TBE) ، و 8.3 مل من 30٪ أكريلاميد ، و 1.25 مل من 50٪ جلسرين ، و 187.5 ميكرولتر من 10٪ بيرسلفات الأمونيوم المحضرة حديثا (APS) ، و 12.5 ميكرولتر من رباعي ميثيل إيثيلين ديامين (TEMED).
   3. لتحضير جل بولي أكريلاميد أصلي بنسبة 20٪ ، اخلطي 5.5 مل من ddH₂O ، و 1.25 مل من 10x TBE ، و 1.25 مل من 50٪ جلسرين ، و 16.7 مل من 30٪ أكريلاميد ، و 187.5 ميكرولتر من 10٪ APS ، و 12.5 ميكرولتر من TEMED.
   4. صب محلول الأكريلاميد على الفور في الجل وأدخل المشط. دع الخليط يتبلمر لمدة 30 دقيقة تقريبا.
3. تشغيل جل
   1. قم بإزالة المشط ، واملأ الخزانات بمخزن تشغيل الرحلان الكهربائي (0.5x TBE).
   2. اشطف آبار العينة بمحلول TBE 0.5x ، ثم قم بتشغيل الجل مسبقا عند 100 فولت على الثلج لمدة 30 دقيقة.
   3. قم بتحميل عينات 20-25 ميكرولتر في كل بئر.
   4. استخدم جل أكريلاميد أصلي بنسبة 10٪ لمقايسة EMSA وهلام أكريلاميد أصلي بنسبة 20٪ للمقايسات الأنزيمية. قم بتشغيل الرحلان الكهربائي عند 100 فولت على الحمام الجليدي حتى تنتقل العلامة الزرقاء البروموفينول إلى الربع السفلي من الجل.
قم
4. بتفكيك ألواح الجل ، وقم بقص الجل عن طريق إزالة آبار التحميل والممرات غير المستخدمة. ضع الجل في المخزن المؤقت TBE 0.5x.
5. قص ورق الترشيح وغشاء النايلون بحجم الجل. بلل ورق الترشيح النظيف وغشاء النايلون مسبقا.
6. قم بتجميع المكدس للنقل.
   1. ضع الغشاء المبلل مسبقا على ورق الترشيح المبلل مسبقا.
   2. ضع الجل على الغشاء.
   3. قم بتغطية الجل بطبقة أخرى من ورق الترشيح المبلل مسبقا.
   4. قم بإزالة جميع فقاعات الهواء عن طريق لف ماصة نظيفة من المركز إلى الحافة.
7. انقل العينات من الجل إلى الغشاء في جهاز كهربائي شبه جاف عند 90 مللي أمبير لمدة 20 دقيقة.
8. أوقف النقل ، ثم جفف الغشاء على ورق ترشيح جديد لمدة 1 دقيقة.
ربط
9. العينات عن طريق تشعيع الغشاء عند 120 مللي جول / سم² لمدة 45-60 ثانية في وصلة متشابكة للأشعة فوق البنفسجية مزودة بمصابيح 254 نانومتر (وظيفة الارتباط المتقاطع التلقائي). جفف الغشاء بالهواء عند RT لمدة 30 دقيقة.
10. كشف التلألؤ الكيميائي
    1. البروتوكول 1: استخدم حجما قياسيا لمجموعة أدوات الكشف عن الحمض النووي الكيميائي التجارية.
       1. أضف 20 مل من المخزن المؤقت للحجب إلى الغشاء واحتضنه لمدة 15-30 دقيقة مع اهتزاز لطيف على دوار عند 20-25 دورة في الدقيقة.
       2. قم بإعداد محلول عازل مترافق / مانع عن طريق إضافة 66.7 ميكرولتر من الستربتافيدين والفجل المترافق إلى 20 مل من المخزن المؤقت للحظر.
       3. قم بإزالة المخزن المؤقت للحظر برفق واستبدله بمخزن مؤقت مترافق / حظر. احتضان لمدة 15 دقيقة على دوار عند 20-25 دورة في الدقيقة.
       4. اغسل الغشاء 4 مرات مع الرج عند 40-45 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق لكل منهما.
       5. أضف 30 مل من المخزن المؤقت لتوازن الركيزة إلى الغشاء. احتضان الغشاء لمدة 5 دقائق مع الاهتزاز عند 20-25 دورة في الدقيقة.
       6. قم بإعداد محلول عمل الركيزة عن طريق إضافة 6 مل من محلول اللومينول / المحسن إلى 6 مل من محلول بيروكسيد مستقر. تجنب الضوء.
       7. قم بتغطية سطح الغشاء بالكامل بمحلول عمل الركيزة واحتضانه لمدة 5 دقائق.
       8. امسح الغشاء في نظام تصوير كيميائي لمدة 1-3 ثوان.

الجدول 1: الابادات المستخدمة لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم شظايا الجينات ل Meiob و Mov10.الحروف العريضة في الاشعال الأمامية والخلفية هي مواقع القطع BamHI و NotI. الأحرف العريضة المائلة في التمهيدي العكسي هي مواقع قطع XhoI. تشير الأحرف الجريئة في المربعات إلى النيوكليوتيدات المقابلة لطفرة النقطة R235A.

شظايا الاشعال التسلسلات (من 5 إلى 3) MEIOB-A أمامي CGGGATCCATGTTACTTTTTGATACACTTGCC عكس فيGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG MEIOB-C أمامي CCGCGTGGATCCATGGAACCAAAATACTTTACAACTTCA عكس CGATGCGGCCGCCTCTTTTTTTTCTCTTATATAATTCAGTAG MEIOB-E أمامي CCGCGTGGATCCATGTTACTTTTTTTGATACACTTGCC عكس CGATGCGGCCGCTACTTTTAGCTGTTCCACTG MEIOB-E-mut أمامي CTCTGATGTGGCAATAAATTTTAAC عكس GTTAAAATTTATTGCCACATCAGAG MOV10 أمامي GACGACGATGACAAGGGATCCATGCCTAGCAAGTTCAGCTGCC عكس GCTTACTCAGCTAAGCTCGAGTCAGAGCTCTCTCCACTCTCTCTCTCTCT

الجدول 2: تسلسل ركائز الحمض النووي / الحمض النووي الريبي المستخدمة في هذا العمل.

للأرقام اسماء التسلسلات (من 5 إلى 3) الشكل 2 ، 5 36 nt ssDNA 5 '-البيوتين-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-3' (الحمض النووي) الشكل 3 36 nt ssRNA 5'-البيوتين-GUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGUGU-3' (الحمض النووي الريبي) الشكل 4 54 nt 5 'ذيل dsRNA 5'-البيوتين-ACCGCUGCCGUCGCUCCG-3' (الحمض النووي الريبي)
5'-ACGAGGGAGACGAGGAGAGCGACGACGCGGG-3'(الحمض النووي الريبي)

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات معدات الطرد المركزي إيبندورف ، ألمانيا 5242 ص نظام التصوير الكيميائي تانون، الصين 5200 سونيفر رقمي برانسون ، الولايات المتحدة الأمريكية BBV12081048A 450 واط ؛ 50/60 هرتز نشاف كهربائي شبه جاف هوفر، الولايات المتحدة الأمريكية TE77XP مسدس الأنبوب كريستال ، الولايات المتحدة الأمريكية 3406051 الوصلة المتقاطعة للأشعة فوق البنفسجية UVP ، الولايات المتحدة الأمريكية CL-1000 المواد غشاء النايلون ثيرمو ساينتفيك ، الولايات المتحدة الأمريكية TG263940A طبق ثقافة معالج ب TC كورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية 430167 100 ملم طبق ثقافة معالج ب TC كورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية 430597 150 مم أنابيب الأنابيب الدقيقة AXYGEN ، الولايات المتحدة الأمريكية MCT-150-C 1.5 مل انابيب كورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية 430791 15 مل الكواشف الخرز المغناطيسي المضاد للعلم M2 سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية M8823 ATP ثيرمو ساينتفيك ، الولايات المتحدة الأمريكية 591136 BCIP / NBT طقم تطوير لون الفوسفاتيز القلوي Beyotime, الصين سي 3206 كاشف تحلل الخلايا CelLyticTM M سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية 107M4071V طقم استنساخ ClonExpress II بخطوة واحدة فازيمي، الصين سي 112 طقم الكشف عن الحمض النووي الكيميائي ثيرمو ساينتفيك ، الولايات المتحدة الأمريكية T1269950 dNTP سيجما ألدريتش ، الولايات المتحدة الأمريكية DNTP100-1 كيلو طن DMEM جيبكو ، الولايات المتحدة الأمريكية 10569044 EDTA Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية AM9260G 0.5 م كوكتيل مثبط البروتياز الخالي من EDTA روش ، الولايات المتحدة الأمريكية 4693132001 مجموعة EndoFree Maxi Plasmid Kit فازيمي، الصين DC202 طقم صغير لاستخراج الحمض النووي جل FastPure فازيمي، الصين DC301-01 FBS جيبكو ، الولايات المتحدة الأمريكية 10437028 الإبلاغ عن الببتيد سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية F4799 الجلسرين سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية SHBK3676 عازلة HEPES سيجما ، الولايات المتحدة الأمريكية SLBZ2837 1 م KOAc سانغون للتكنولوجيا الحيوية ، الصين 127-08-02 كلوريد المغنيسيوم 2 Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية AM9530G 1 م كلوريد الصوديوم Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية AM9759 5 م NP-40 أمريسكو ، الولايات المتحدة الأمريكية M158-500 مل Opti-MEM متوسط جيبكو ، الولايات المتحدة الأمريكية 31985062 برنامج تلفزيوني جيبكو ، الولايات المتحدة الأمريكية 10010023 الرقم الهيدروجيني 7.4 مثبط RNase Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية N251B ستربتافيدين الفوسفاتيز القلوي Promega ، الولايات المتحدة الأمريكية الطراز V5591 تي بي إي Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية 15581044 عازلة Tris-HCI Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية 15567027 1 م ، درجة الحموضة 7.4 عازلة Tris-HCI Invitrogen ، الولايات المتحدة الأمريكية 15568025 1 م ، درجة الحموضة 8.0 توين 20 سانغون للتكنولوجيا الحيوية ، الصين A600560