التصور القائم على التألق المناعي لتفاعلات بروتين إصلاح الحمض النووي

الملخص

المصدر: de la Peña Avalos ، B. ، et al. ، تصور تفاعل بروتينات إصلاح الحمض النووي عن طريق التألق المناعي. J. Vis. Exp. (2020).

في هذا الفيديو ، نصف طريقة التألق المناعي لتصور توطين بروتينات إصلاح الحمض النووي γH2AX و 53BP1 في مواقع فواصل الحمض النووي مزدوجة الخيط في نوى الخلايا المشععة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. الاستخراج النووي وتثبيت الخلايا

1. تحضير محاليل المخزون: 0.2 م أنابيب (درجة الحموضة 6.8) ، 5 م كلوريد الصوديوم ، 2 م سكروز ، 1 م مغنليدميكلوريد₂ ، 0.1 م EGTA (درجة الحموضة 8.0).
2. تحضير مخزن الاستخراج النووي (NEB): قم بإذابة 10 ملي مولار أنابيب (درجة الحموضة 6.8) ، 100 ملي كلوريد الصوديوم ، 300 ملي سكروز ، 3 ملي مللي كلوريد₂ ، 1 ملي مولار EGTA (درجة الحموضة 8.0) و 0.5٪ (حجم حجم / حجم) تريتون X-100 في ddH₂O. تخلط حتى تذوب تماما.
3. تحضير 4٪ (حجم / حجم) بارافورمالدهيد (PFA): قم بإذابة 10 مل من محلول مائي 16٪ PFA في 30 مل من PBS. تخلط حتى تذوب تماما.
4. في الوقت المناسب (ر = 0 ، 1 ، 2 ، 4 ، 16 ساعة) ، اغسل الخلايا مرتين باستخدام 1 مل من PBS. قم بإزالة PBS تماما.
5. أضف 200 ميكرولتر من NEB إلى كل بئر لاستخراج نوى الخلية (السيتوبلازم متحلل ، وتبقى النواة فقط) (الشكل 1). احتضن لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة وقم بإزالته تماما.
   ملاحظه: لا تتجاوز 2 دقيقة.
6. اغسل الخلايا ب 1 مل من PBS. قم بإزالة PBS تماما. أضف PBS بعناية ، فالخلايا هشة للغاية في هذه الخطوة.
7. أضف 200 ميكرولتر من 4٪ (حجم / حجم) PFA إلى كل بئر لتثبيت الخلية. احتضن لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة PFA تماما.
8. أضف 1 مل من PBS.
   ملاحظه: يمكن تخزين الخلايا في PBS عند 4 درجات مئوية.

فئة

2. تلطيخ التألق المناعي

1. تحضير محلول الحظر: قم بإذابة 5٪ BSA (w / v) في PBS وأضف 0.3٪ (حجم / حجم) Triton X-100. تخلط حتى تذوب تماما.
2. تحضير المخزن المؤقت للتخفيف: قم بإذابة 1٪ BSA (وزن / حجم) في PBS وأضف 0.3٪ (حجم حجمي) Triton X-100. تخلط حتى تذوب تماما.
3. للسد ، أضف 200 ميكرولتر من محلول الحجب لكل بئر. احتضان لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو 16-18 ساعة عند 4 درجات مئوية
   ملاحظه: إذا تم استخدام الجسم المضاد للماعز ، أضف 5٪ مصل الماعز إلى محلول الحظر.
4. تمييع الجسم المضاد الأولي في المخزن المؤقت للتخفيف (1: 500 ؛ انظر الجدول 1 للحصول على قائمة الأجسام المضادة) والدوامة حتى تمتزج جيدا.
   ملاحظه: إذا تم استخدام الجسم المضاد للماعز ، أضف مصل الماعز بنسبة 1٪ إلى المخزن المؤقت للتخفيف.
5. في صندوق الرطوبة / الحضانة ، قم بلصق قطعة من البارافيلم أضف 10 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي (في قطرة واحدة). قم بمحاذاة إحدى حواف الغطاء مع القطرة وقم بإنزلها ببطء على البارافيلم ، حتى ينتشر السائل في جميع الأنحاء (تجنب الفقاعات إن أمكن). احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
6. اغسل الأغطية ثلاث مرات في PBS لمدة 1 دقيقة.
7. تمييع الجسم المضاد الثانوي في مخزن التخفيف (التركيز النهائي: 2 ميكروغرام / مل) والدوامة حتى تمتزج جيدا.
8. ضع 10 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي كما هو موضح للأجسام المضادة الأولية. احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: حماية من الضوء.

الجدول 1: الأجسام المضادة المستخدمة. قائمة الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة.

جسم شركة مرجع مصدر 53 طفرة 1 إشارات الخلية 4937 أرنب مضاد للفأر IgG H& L (Alexa Fluor 647) أبكام AB150103 حمار مضاد الفوسفو هيستون H2A. X (Ser139) ، استنساخ JBW301 ميليبور 05-636 فأر مضاد للأرانب IgG H&L (Alexa Fluor 488) أبكام AB150081 ماعز

9. اغسل الأغطية ثلاث مرات في PBS لمدة 1 دقيقة.
10. اغسل الأغطية باستخدام H₂O لمدة 1 دقيقة.
11. صبغة الحمض النووي المضادة باستخدام DAPI: ضع 10 ميكرولتر من 300 نانومتر DAPI (كما هو موضح للأجسام المضادة) ، واحتضن لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ثم قم بتثبيته على شريحة زجاجية باستخدام وسائط تثبيت قائمة على الجلسرين. بدلا من ذلك، أضف قطرة واحدة (10 ميكرولتر) من وسائط التثبيت التجارية المضادة للبهتان التي تحتوي على DAPI على شريحة وقم بتطبيق غطاء للغطاء. اضغط برفق على الغطاء وقم بإزالة السوائل الزائدة حوله بمنشفة ورقية.
12. ختم الأغطية بطلاء أظافر شفاف واتركها تجف لمدة 20 دقيقة.
13. قم بتخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية.

3. الحصول على الصور

1. ضع قطرة من زيت الغاطس على العدسة الموضوعية 60x. استخدم DAPI لتحديد موقع النوى من خلال قطعة العين.
   1. للحصول على صور XYZ ، افتح برنامج الاستحواذ وحدد المعلمات: نوع الماسح الضوئي: Galvano. وضع الماسح الضوئي: ذهابا وإيابا. حجم الصورة: 512×512; وضع PMT: VBF ؛ متوسط PMT: الإطار (4 مرات) ؛ المسح المتسلسل PMT: خط.
   2. حدد الصبغة وأجهزة الكشف:
      القناة (CH1) ، الصبغة (DAPI) ، الكاشف (SD1)
      القناة (CH2) ، الصبغة (Alexa Fluor 488) ، الكاشف (HSD3)
      القناة (CH3) ، صبغ (Alexa Fluor 647) ، كاشف (HSD4)
   3. حدد ON في "Z".
2. اضبط الصورة الحية. اضغط على زر Live في نافذة Live.
   1. اضبط التركيز وضبط شدة الليزر (٪) ، والحساسية (HV) ، والكسب والإزاحة على نافذة أداة "PMT".
      1. اضبط شدة الليزر (٪): للسطوع والتبييض. كلما زادت شدة الليزر ، زادت قوة الإشارة ، لكن العينة سوف تبيض ضوئي.
      2. اضبط الحساسية (HV): مستوى الضوضاء. كلما ارتفعت HV ، زادت الإشارة ، لكن الصورة ستكون صاخبة إذا كانت عالية جدا.
         ملاحظة: حافظ دائما على ثبات الجهد.
      3. اضبط الإزاحة: مستوى الخلفية.
   2. حدد بدء/نهاية (15 شريحة)، لمكدسات Z.
3. ابدأ عملية الاستحواذ.
   1. حدد المجلد لحفظ الصور. اضغط على زر LSM Start (ابدأ) لبدء الحصول على الصورة. اضغط على زر Series Done لإكمال الحصول على الصورة.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1. الاستخراج النووي.

صور تمثيلية للخلايا قبل الاستخراج النووي (على اليسار) وبعد (يمين). يجب هضم السيتوبلازم ولكن يجب أن يظل التركيب النووي سليما بعد الاستخراج (يمين). (أ) تكبير 20 ضعفا؛ شريط المقياس = 20 ميكرومتر و (ب) تكبير 40x ؛ شريط المقياس = 10 ميكرومتر.

المواد