مقالة منهجية

مقايسة سحب بروتين الحمض النووي الريبي لعزل البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي عن طريق استخراج التقارب

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Kresoja-Rakic, J., et al. تنقية Desthiobiotin-Streptavidin-Affinity بوساطة البروتينات المتفاعلة مع الحمض النووي الريبي في خلايا ورم الظهارة المتوسطة. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو مقايسة منسدلة للحمض النووي الريبي في المختبر لتحديد البروتينات المرتبطة بالحمض النووي الريبي (RBPs) ، والتي تتفاعل مع تسلسل العنصر الغني بالأدينيلات واليوريديلات (ARE) في mRNA. يتم خلط RBPs المستهدفة من محللة الخلية مع مسبار الحمض النووي الريبي لتشكيل مجمعات بروتين الحمض النووي الريبي. يتم عزل المجمعات عن طريق تنقية التقارب باستخدام تقارب ملصق الديسثيوبيوتين لمسبار الحمض النووي الريبي مع حبة مغناطيسية تحمل علامة الستربتافيدين.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تحضير جزء البروتين العصاري الخلوي والنووي

  1. لوحة 4 × 106 خلايا ACC-MESO-4 في قارورة ثقافة خلية T150 نمت في وسط RPMI - 1640 مكملة بنسبة 10٪ FBS و 1x بنسلين / ستربتومايسين (100x) و 2 ملي مولار L-Glutamine (200 ملليمتر). عندما تصل الخلايا إلى التقاء 80-90٪ (~ 5-5.5 × 106 خلايا) ، استمر في استخراج البروتين للأجزاء النووية والعصارة الخلوية.
    ملاحظه: تم الحصول على خط خلايا ACC-MESO-4 من مركز الموارد الحيوية RIKEN.
  2. شفط وسط ، اغسل الخلايا بإضافة 15 مل من 1x PBS ، قم بإمالة اللوحة برفق عدة مرات ، وشفط 1x PBS. أضف 3 مل من 0.25٪ Trypsin-EDTA واحتضن قارورة الاستزراع عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق
    ملاحظه: انظر إلى الخلايا تحت المجهر للانفصال. إذا كان لا يزال متصلا ، فاضغط على القارورة على راحة اليد 3 مرات.
  3. أضف 7 مل من وسط RPMI-1640 مكملا بنسبة 10٪ FBS ، و 1x بنسلين / ستربتومايسين (100x) ، و 2 ملي من L-Glutamine (200 مل) ، واجمع الخلايا في أنبوب سعة 15 مل ، ثم قم بالدوران عند 200 × جم لمدة 5 دقائق.
    4. قم
  4. بشفط وسط وإعادة تعليق حبيبات الخلية ب 1.5 مل من 1x PBS ، ثم انقل الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. قم بالدوران عند 500 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية
    ملاحظه: من هذه الخطوة فصاعدا ، قم بتنفيذ جميع خطوات الطرد المركزي عند 4 درجات مئوية واحتفظ بجميع الكواشف على الجليد.
  5. أعد تعليق حبيبات الخلية ب 1.5 مل من 1x PBS وقم بتدوير الخلايا عند 500 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 3 دقائق><. ملاحظه: الكميات المطلوبة من كواشف CER I و CER II و NER هي 10 و 0.55 و 5 مجلدات من الحجم المقدر لبيليه الخلية المعبأة ، على التوالي ؛ يفترض البروتوكول التالي حجما قدره 20 ميكرولتر. نوصي بإعداد الكمية المطلوبة فقط من كاشف CER I.
  6. أضف 200 ميكرولتر من كاشف الاستخراج السيتوبلازمي المثلج (CER I) المكمل ب 2 ميكرولتر من مثبط البروتيناز 1x ، على سبيل المثال ، قم بتخفيف قرص واحد من مثبط البروتياز (خال من EDTA) في 500 ميكرولتر من الماء للحصول على مخزون 100x. هذه الكمية من الكاشف CER I تكفي لتحلل 20 ميكرولتر من حجم خلية معبأة بالحبيبات.
    1. لتقدير حجم حبيبات الخلية المعبأة, قارن الأنبوب الذي يحتوي على حبيبات الخلية بأنبوب 1.5 مل مملوء ب 10, 20, 50, أو 100 ميكرولتر من 1x PBS.
  7. أعد تعليق حبيبات الخلية عن طريق دوامة الأنبوب بقوة لمدة 15 ثانية واحتضان الأنبوب على الجليد لمدة 10 دقائق. أضف 11 ميكرولتر من كاشف الاستخراج السيتوبلازمي المثلج II (CER II) إلى الأنبوب ، وقم بدوامة قوية لمدة 5 ثوان ، واحتضن لمدة دقيقة واحدة على الجليد.
    8. قم
  8. بتدوير الدوامة بقوة لمدة 5 ثوان وقم بالطرد المركزي للأنبوب عند 16,000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق. المادة الطافية هي الجزء السيتوبلازمي الذي يستخدم بشكل أكبر في تجربة الحمض النووي الريبي المنسدل.
  9. أعد تعليق الحبيبات المتبقية في 100 ميكرولتر من كاشف الاستخراج النووي المثلج (NER) المكمل ب 1 ميكرولتر من مثبط البروتيناز (100x) ودوامة قوية لمدة 15 ثانية. نوصي بإعداد الكمية المطلوبة فقط من كاشف NER المكمل بمثبطات الإنزيم البروتيني.
  10. احتضن العينة على الجليد لمدة 40 دقيقة مع دوامة عرضية لمدة 15 ثانية (كل 10 دقائق).
  11. قم بالطرد المركزي للأنبوب عند 16,000 × جم لمدة 10 دقائق. انقل المادة الطافية (هذا هو جزء البروتين النووي) إلى أنبوب نظيف مبرد مسبقا.
  12. تابع على الفور عن طريق قياس تركيز البروتين باستخدام طريقة البيسنشونيني (BCA) (انظر جدول المواد). للتحكم في نقاء البروتين لكل جزء ، قم بإجراء النشاف المناعي (الشكل 1) ضد α-tubulin (الكشف الإيجابي فقط في الجزء العصاري الخلوي) و Poly ADP-ribose polymerase - PARP (الكشف الإيجابي فقط في الجزء النووي).
  13. من أجل الحفاظ على نشاط البروتين وحالته الأصلية ، قم بإعداد 25 ميكرولتر من مستخلصات العصارة الخلوية والنووية. قم بتجميد هذه الكميات عن طريق وضعها في النيتروجين السائل لمدة 5 ثوان وتخزينها مباشرة عند -80 درجة مئوية.
فئة

2. وضع العلامات على الحمض النووي الريبي ب Desthiobiotin

  1. قم بتصنيع مجسات الحمض النووي الريبي تجاريا وتنقية HPLC. أعد التعليق بالماء الخالي من النوكلياز عند 10 ميكرومتر < / > ملاحظه: يتم سرد تسلسلات المسبار في الجدول 1.
  2. استخدم 50 ملي مول من الحمض النووي الريبي لكل تفاعل منسدل للحمض النووي الريبي. قم بإذابة الثلج والاحتفاظ بجميع الكواشف على الجليد باستثناء PEG 30٪ ، المستخدمة لتسمية الطرف 3 'من الحمض النووي الريبي oligo.
  3. انقل 5 ميكرولتر من مجسات الحمض النووي الريبي 10 ميكرومتر ، المسماة باسم CALB2 3 'UTR (ARE) و CALB2 3' UTR (mtARE) و Unrelated-RNA (IRE) ، إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة رقيقة الجدار 0.5 مل واحتضانها في جهاز PCR عند 85 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. ضع الأنابيب على الفور على الجليد.
    ملاحظه: هذه الخطوة مهمة ، لأنها تعزز الاسترخاء وإمكانية الوصول إلى مسبار الحمض النووي الريبي لوضع العلامات.
  4. لتفاعل واحد 30 ميكرولتر ، أضف إلى الأنبوب المحتوي على الحمض النووي الريبي مزيج 10 ميكرولتر التالي: 3 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، 3 ميكرولتر من 10x RNA Ligase Interaction Buffer ، 1 ميكرولتر من مثبط RNase (40 U / μL) ، 1 ميكرولتر من ثنائي فوسفات السيتيدين الديسثيوبيوتينيل (1 ملي مولار) ، و 2 ميكرولتر من T4 RNA ligase (20 وحدة / ميكرولتر).
    ملاحظه: لتحضير مزيج رئيسي A ل 3 عينات زائدة (3.2) ، امزج 9.6 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز ، و 9.6 ميكرولتر من 10x RNA Ligase Reaction Buffer ، و 3.2 ميكرولتر من مثبط RNase (40 U / μL) ، و 3.2 ميكرولتر من ثنائي فوسفات السيتيدين الديسثيوبيوتينيل (1 ملي مولار) ، و 6.4 ميكرولتر من T4 RNA ligase (20 U / μL).
  5. أضف بعناية 15 ميكرولتر من PEG 30٪ إلى التفاعل. استخدم طرفا آخر لخلط التفاعل. احتضان التفاعل طوال الليل عند 16 درجة مئوية.
  6. في اليوم التالي ، قم بإعداد ما يلي: 5 M كلوريد الصوديوم (طازج / خالي من النوكلياز) ، الكلوروفورم: كحول الأيزواميل بنسبة 24: 1 (على سبيل المثال ، لكل تفاعل - 96 ميكرولتر من الكلوروفورم و 4 ميكرولتر من كحول الأيزواميل) ، ومثلج بارد 100٪ إيثانول ، ومثلج بارد 70٪ إيثانول.
  7. أضف 70 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز إلى أنابيب تفاعل وضع العلامات على الحمض النووي الريبي. أضف 100 ميكرولتر من الكلوروفورم: كحول الأيزواميل والدوامة لفترة وجيزة. قم بالدوران عند 13,000 × جم لمدة 3 دقائق. قم بإزالة المرحلة العليا فقط بعناية ونقلها إلى أنبوب جديد خال من النوكلياز سعة 1.5 مل ؛ تجنب لمس المرحلة السفلية.
  8. أضف 10 ميكرولتر من 5 M كلوريد الصوديوم ، و 1 ميكرولتر من الجليكوجين ، و 300 ميكرولتر من الإيثانول المثلج البارد بنسبة 100٪. ضع الأنبوب عند -20 درجة مئوية لمدة 2 ساعة < / > ملاحظه: في هذه الخطوة ، يمكن متابعة التجربة في اليوم التالي.
  9. جهاز طرد مركزي عند 13,000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. أضف 300 ميكرولتر من الإيثانول المثلج البارد بنسبة 70٪ وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى عند 13,000 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 5 دقائق.
  10. تخلص من المادة الطافية تماما وجفف الحبيبات بالهواء (15 دقيقة). أعد تعليق الحبيبات في 20 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.
    ملاحظه: تابع مع سحب الحمض النووي الريبي في نفس اليوم.
  11. احتضان الحمض النووي الريبي عند 90 درجة مئوية لمدة دقيقتين وضعه على الجليد. ضع الحمض النووي الريبي المسمى على الجليد أثناء الخطوة التالية من الغسيل المسبق للحبات المغناطيسية ستربتافيدين.
    ملاحظه: قد يؤدي وقت الحضانة الأطول إلى إتلاف مسبار الحمض النووي
    12. الريبي.
فئة

3. سحب بروتين الحمض النووي الريبي

  1. الغسيل المسبق للحبيبات المغناطيسية للستربتافيدين وحضانة الحضانة باستخدام ديسثيوبيوتين-الحمض النووي الريبي
    1. استخدم 50 ميكرولتر من حبات الستربتافيدين المغناطيسية لكل 50 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي. ومع ذلك ، يجب تحسين هذا اعتمادا على التجربة.
    2. قم بتدوير الأنبوب بخرز الستربتافيدين المغناطيسي لمدة 15 ثانية، وقم بإزالة 200 ميكرولتر بسرعة (مزيج رئيسي؛ يكفي لتفاعلات 3+1) في أنبوب قفل آمن نظيف سعة 1.5 مل باستخدام أطراف ماصة مقطوعة. ضع الأنبوب على حامل مغناطيسي بحيث تتجمع الخرزات على جانب الأنبوب وانتظر 1 دقيقة. قم بإزالة سائل إعادة التعليق.
    3. لغسل الخرز، قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي، وأضف 400 ميكرولتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم، ومحلول 0.05 M كلوريد الصوديوم، ثم قم بسحب الأنبوب برفق لأعلى ولأسفل عدة مرات. ضع الأنبوب مرة أخرى على الحامل المغناطيسي. انتظر 1 دقيقة واجمع المادة الطافية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
    4. اغسل الخرزات ب 200 ميكرولتر من 100 ملي كلوريد الصوديوم. قم بإزالة المادة الطافية.
    5. أضف 200 ميكرولتر من 20 ملي مولار تريس (درجة الحموضة 7.5) ، وأعد تعليق الخرزات عن طريق سحب العينات ، ضع الأنبوب على الحامل المغناطيسي ، وانتظر لمدة دقيقة واحدة ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. كرر الخطوة.
    6. قم بإزالة الأنبوب من الحامل المغناطيسي ، وأضف 200 ميكرولتر من 1x RNA Capture المؤقت ، وأعد تعليق حبات الستربتافيدين المغناطيسية عن طريق الدوامة لفترة وجيزة. قم بإزالة 50 ميكرولتر من حبيبات الستربتافيدين المغناطيسية وأضفها إلى كل أنبوب RNA مسمى باستخدام طرف ماصة مقطوع. احتضان الأنابيب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على الأسطوانة.
  2. ربط البروتين بالحمض النووي الريبي
    1. ضع الأنابيب في حامل مغناطيسي ، وانتظر 1 دقيقة ، ثم قم بإزالة المادة الطافية.
    2. أضف 50 ميكرولتر من 20 ملي تريس (درجة الحموضة 7.5) إلى الخرزات وأعد تعليقها عن طريق سحب العينات. ضع الأنابيب في حامل مغناطيسي ، وانتظر 1 دقيقة ، ثم قم بإزالة المادة الطافية. كرر هذه الخطوة.
    3. أضف 100 ميكرولتر من 1x مخزن مؤقت لربط البروتين-RNA إلى الخرزات وأعد تعليقها عن طريق سحب العينات.
    4. في غضون ذلك ، قم بإعداد المزيج التالي: 10 ميكرولتر من 10x مخزن مؤقت لربط البروتين والحمض النووي الريبي ، و 30 ميكرولتر من 50٪ جلسرين ، و 50 ميكروغرام من البروتينات السيتوبلازمية ، وماء خال من النوكلياز حتى 100 ميكرولتر < br / > ملاحظه: قم بإعداد مزيج رئيسي B ل 3 عينات زائدة (3.3) على النحو التالي: 33 ميكرولتر من 10x مخزن مؤقت لربط البروتين والحمض النووي الريبي ، 99 ميكرولتر من 50٪ جلسرين ، 165 ميكروغرام من البروتينات السيتوبلازمية والماء الخالي من النوكلياز حتى 330 ميكرولتر.
    5. ضع الأنابيب في الحامل المغناطيسي ، وانتظر 1 دقيقة ، واجمع المادة الطافية. أضف 100 ميكرولتر من المزيج الرئيسي B، وأعد تعليقه عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل، وتجنب تكوين الفقاعات. احتضان أنابيب التفاعل لمدة 60 دقيقة عند 4 درجات مئوية على الأسطوانة.
  3. الغسيل والشطف
    1. ضع الأنابيب في حامل مغناطيسي ، واجمع المادة الطافية (التي تتدفق من خلال - FT) ، وانقلها إلى أنبوب جديد.
      ملاحظه: احتفظ ب FT على الجليد لتحليلها لاحقا.
    2. ماصة 100 ميكرولتر من 1x اغسل المخزن المؤقت على الخرزات ، وأعد تعليقها برفق ، وأعدها إلى الحامل المغناطيسي ، وانتظر 1 دقيقة ، وتخلص من المادة الطافية. كرر هذه الخطوة 2 مرات.
    3. أضف 40 ميكرولتر من Elution Buffer إلى الخرز المغناطيسي ، واخلطه عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ، واحتضانه عند 37 درجة مئوية على شاكر أنبوب (950 دورة في الدقيقة) لمدة 30 دقيقة.
    4. ضع الأنابيب في حامل مغناطيسي ، وانتظر 1 دقيقة ، واجمع العينة المملوءة (وهي التصفية - E). ضعه على الجليد واستخدمه لتحليل المصب.
      ملاحظه: في هذه الخطوة ، يتكون كل مسبار RNA تم اختباره من عينة تدفق (FT) وشطف (E).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تحليل اللطخة الغربية ل 5 ميكروغرام من جزء البروتين العصاري الخلوي والنووي. يوجد بروتين PARP في الجزء النووي (N) ولكنه غائب عن جزء العصارة الخلوية (C). يوجد α-توبولين في الجزء العصاري الخلوي (C) ولكنه غائب في الجزء النووي (N).

الجدول 1: تسلسل مجسات الحمض النووي الريبي

...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات طقم الاستخراج النووي والسيتوبلازمي NE-PER ثيرمو فيشر العلمي 78833 أقراص بيرس المثبطة للبروتياز ، خالية من EDTA ثيرمو فيشر العلمي أ32965 بيرس BCA مجموعة فحص البروتين ثيرمو فيشر العلمي هاتف: 23225 بيرس المغناطيسي RNA-بروتين المنسدلة طقم ثيرمو فيشر العلمي 20164 يتضمن حبات مغناطيسية وبالتالي يجب تخزين المجموعة عند 4 درجات مئوية بيرس الحمض النووي الريبي 3 'مجموعة إزالة البيوتينيل النهائي ثيرمو فيشر العلمي 20163 المجموعة هي جزء من "مجموعة بيرس المغناطيسية للبروتين الحمض النووي الريبي" ، ويجب تخزينها عند -20 درجة مئوية على عكس المجموعة المنسدلة (4 درجات مئوية). DynaMag-2 ، حامل مغناطيسي ثيرمو فيشر العلمي 12321 د RPMI - 1640 متوسط سيجما ألدريتش R8758 FBS - مصل الأبقار المرشح بان بيوتك P40-37500 البنسلين - الستربتومايسين (100x) سيجما ألدريتش ص 4333 محلول L-Glutamine (200 ملم) سيجما ألدريتش جي 7513 0.25٪ تريبسين EDTA (1x) جيبكو من لايف تكنولوجيز هاتف: 25200-056 حل إزالة التلوث RNaseZap RNase ثيرمو فيشر العلمي AM9780 تخليق الحمض النووي الريبي oligo Mycrosynth AG ، سويسرا - مقياس التوليف - 0.04 ميكرولتر - منقى HPLC ألبومين مصل الأبقار سيجما ألدريتش أ 7030 حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) 6 م PanReac AppliChem هاتف: 182883.1211 فائق النقاء 1 متر تريس ، درجة الحموضة 7.5 ثيرمو فيشر العلمي 15567027 الجلسرين ثيرمو فيشر العلمي 17904 50٪ من الحصص المعقمة ليتم تخزينها عند -20 درجة مئوية بيرس ستربتافيدين الخرز المغناطيسي ثيرمو فيشر العلمي 88817 يرجى ملاحظة أن متوسط قطر هذه الخرزات المغناطيسية 1 ميكرومتر (يتراوح من 0.5 - 1.5 ميكرومتر). علاوة على ذلك ، تستخدم Dynabeads-M280 Streptavidin ، وهي حبات بحجم متجانس 2.8 ميكرومتر ، أيضا في سحب الحمض النووي الريبي ولكن كن على دراية بأن هذا قد يؤثر على عملية التنقية. كبريتات الألومنيوم - (14-18) - هيدرات سيجما ألدريتش 368458 حمض الفوسفوريك أبليشم أ 0637

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA RNA

مقالات ذات صلة