$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. تفاعل ربط البروتين وفصل الحمض النووي الريبي المرتبط
- إجراء ربط البروتين والحمض النووي الريبي في 10 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.5 في حجم 100 ميكرولتر عن طريق إضافة المكونات التالية إلى هذه التركيزات النهائية: 50 ملي مولار KCl ، 1 ملي مولار DTT ، 0.09 ميكروغرام / ميكرولتر ألبومين مصل بقري ، 0.5 وحدة / ميكرولتر RNasin ، 0.15 ميكروغرام / ميكرولتر tRNA ، 1 ملي EDTA ، و 30 ميكرولتر من تركيز البروتين المؤتلف المناسب (PTB). أضف الحمض النووي الريبي من التجمع المناسب.
ملاحظه: يرتبط عامل التضفير U2AF65 عادة بمواقع لصق البولي بيريميدين / 3 'للإنترونات النموذجية مع تقارب ربط (ثابت تفكك التوازن أو Kd) حوالي 1-10 نانومتر. لذلك ، استخدمت الجولتان الأوليان من الربط تركيز البروتين بمقدار 10 أضعاف فوق Kd ل U2AF65 ؛ بالنسبة لبروتينات SXL و PTB ، كان تركيز البداية في هذا النطاق هو أفضل تخمين لدينا. هذا يضمن أن أنواع الحمض النووي الريبي المرغوبة يمكن أن ترتبط ، على الرغم من أن تسلسلات التقارب المنخفضة كانت مرتبطة أيضا. في الجولتين 3 و 4 (النسخ والربط والتضخيم) ، تم تقليل تركيز البروتين ثلاثة أضعاف. تم ذلك للقضاء بنجاح على أنواع الحمض النووي الريبي منخفضة التقارب.
- ضع الأنابيب التي تحتوي على تفاعلات الربط لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية في كتلة درجة حرارة (أو على الجليد).
- قم بتجزئة الحمض النووي الريبي المرتبط من الحمض النووي الريبي غير المرتبط لأول 4 جولات من تضخيم التحديد باستخدام الخطوات التالية.
- قم بتصفية العينة (100 ميكرولتر) في درجة حرارة الغرفة من خلال مرشح النيتروسليلوز المتصل بمشعب فراغ.
ملاحظه: يظل مركب بروتين الحمض النووي الريبي ، ولكن ليس الحمض النووي الريبي غير المرتبط ، على المرشح.
- قم بتقطيع المرشح باستخدام الحمض النووي الريبي المحتفظ به إلى شظايا بشفرة حلاقة معقمة ؛ أدخلها في أنبوب الطرد المركزي. استرجع الحمض النووي الريبي عن طريق تقليب الأنبوب برفق لمدة لا تقل عن 3 ساعات (أو بين عشية وضحاها) باستخدام قطع مرشح مغمورة في المخزن المؤقت للبروتيناز K (PK).
- قم بإزالة البروتين من عينة الحمض النووي الريبي عن طريق دوامها في وجود حجم متساو من الفينول كلوروفورم (1: 1) ثم الكلوروفورم. استرجع المرحلة المائية في كل مرة عن طريق الطرد المركزي للعينة بسرعة عالية لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- امزجه مع أسيتات الصوديوم (0.1 حجم 3.0 م ، درجة الحموضة 5.2) والإيثانول (2-3 أحجام من الإيثانول المطلق ، 200 دليل). اترك الأنبوب في فريزر -80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، وقم بطرده بسرعة عالية لمدة 10 دقائق ، وباتباع خطوات الغسيل والتجفيف ، قم بإذابة الحمض النووي الريبي في الماء المعالج ب DEPC.
- افصل كسور الحمض النووي الريبي المرتبطة بالبروتين عن الكسور غير المنضمة لآخر جولتين (الجولتان 5 و 6 ؛ النسخ والربط والتضخيم) على النحو التالي. قلل تركيز البروتين في تفاعل الربط (الخطوة 1.1) بمقدار ثلاثة أضعاف أخرى لضغط اختيار إضافي لإثراء تسلسلات الربط عالية التقارب وإزالة التسلسلات منخفضة التقارب بشكل تفضيلي.
- صب جل بولي أكريلاميد أصلي مسبقا (5٪ مع نسبة 60: 1 أكريلاميد: ثنائي أكريلاميد) في محلول TBE 0.5x (Tris-Borate-EDTA) قبل إعداد تفاعل ربط البروتين أعلاه: (الخطوة 1.1). قم بكهرباء هذا الجل في غرفة باردة (4 درجات مئوية) عن طريق تطبيق 250 فولت لمدة 15 دقيقة.
- ماصة الحمض النووي الريبي أعلاه: تفاعلات ربط البروتين (الخطوة 1.1) في آبار مختلفة من هذا الجل.
ملاحظه: يتم تخزين البروتين عند -80 درجة مئوية ويتم تخفيفه قبل استخدامه في 20 ملي مولار 4- (2-هيدروكسي إيثيل) بيبيرازين -1-حمض إيثان سلفونيك (HEPES) ، درجة الحموضة 8.0 ، 20٪ جلسرين ، 0.2 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، 0.05٪ NP-40 ، و 1 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT). إضافة 0.5-1.0 ملي مولار مثبط فينيل ميثان سلفونيل فلوريد (PMSF) اختياري. في تفاعل الربط ، يساهم هذا المخزن المؤقت بحوالي 6٪ من الجلسرين ، مما يسمح بالتحميل المباشر للعينات في الآبار دون الحاجة إلى مزجها مع مخزن مؤقت منفصل لتحميل الهلام.
- قم بتجزئة الحمض النووي الريبي المرتبط من الحمض النووي الريبي غير المرتبط باستخدام الرحلان الكهربائي للهلام في غرفة باردة (4 درجات مئوية) عند 250 فولت لمدة 1 إلى 2 ساعة. تعرف هذه العملية أيضا باسم مقايسة تحول حركة الهلام.
ملاحظة: تختلف مدة الرحلان الكهربائي اعتمادا على ميزات الحمض النووي الريبي والبروتين المستخدم في الربط.
- قم بتعريض الجل لفيلم الأشعة السينية وتحديد موقع الحمض النووي الريبي المرتبط باستخدام التصوير الشعاعي الذاتي. اقطع شريحة الجل باستخدام الحمض النووي الريبي المرتبط وأدخلها في أنبوب.
- احتضان شريحة الجل المكسرة في المخزن المؤقت PK المستخدم للشطف لمدة 3 ساعات أو طوال الليل.
- دوامة عينة الحمض النووي الريبي المملوثة بقوة أولا باستخدام الفينول كلوروفورم ثم باستخدام الكلوروفورم.
- اخلطي أسيتات الصوديوم والإيثانول مع المرحلة المائية بعد استخراج الكلوروفورم. بعد الحضانة في فريزر -80 درجة مئوية ، قم بالدوران عند 4 درجات مئوية لمدة 5-10 دقائق لجمع حبيبات الحمض النووي الريبي. اغسل حبيبات الحمض النووي الريبي بالإيثانول وجففها في الهواء عن طريق ترك غطاء الأنبوب مفتوحا. قم بإذابة الحمض النووي الريبي في الماء المعالج ب DEPC.
ملاحظه: يسمح التحول إلى مقايسة تحول حركة الهلام للتجزئة بالقضاء على أنواع الحمض النووي الريبي غير المرغوب فيها التي ربما تم إثرائها للارتباط ، على سبيل المثال ، بمرشح النيتروسليلوز هنا (أو أي مصفوفة) المستخدمة في الجولات الأولية للتجزئة.
< p class = "jove_title" >
2. النسخ العكسي وتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل
- قم بتصنيع (كدنا) من الحمض النووي الريبي المذاب باستخدام النسخ العكسي والتمهيدي العكسي عن طريق احتضان تفاعل 20 ميكرولتر (2 ميكرولتر من 10x RT Buffer ، 2 ميكرولتر من النسخ العكسي AMV ، التمهيدي العكسي 1 ميكرومتر ، 10 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي ، مثبط RNase اختياري) عند 42 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- تضخيم الحمض النووي (كدنا) باستخدام 20-25 دورة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). قم بإرفاق محفز بوليميراز T7 RNA بالمكتبة عن طريق تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الذي يحتوي على قالب مكتبة عشوائي للحمض النووي 1 ميكرومتر ، و 1 ميكرومتر من كل برايمر ، و 20 ملي مولار تريس (درجة الحموضة 8.0) ، و 1.5 ملي مولار MgCl2 ، و 50 ملي مولار KCl ، و 0.1 ميكروغرام / ميكرولتر ألبومين مصل الأبقار الأسيتيل ، ووحدتان من بوليميراز Taq ، و 200 ميكرومتر لكل من dNTPs (ديوكسيجوانوزين ، ديوكسي أدينوزين ، ديوكسي سيتيدين ، وديوكسي ثيميدين ثلاثي الفوسفات).
< p class = "jove_title" >
3. النسخ وربط البروتين
- كرر عملية تخليق الحمض النووي الريبي ، وربط البروتين ، وفصل الكسور المرتبطة بالبروتين وغير المرتبطة.