الرحلان الحراري المجهري لدراسة تفاعلات البروتين والدهون في المحلول

الملخص

المصدر: Sparks، R. P. et al.، استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس تفاعلات البروتين والدهون.J. Vis. Exp.(2022)

يوضح هذا الفيديو الرحلان الحراري المجهري لدراسة التفاعل بين البروتين والدهون. يكتشف الاختبار التفاعل بين الجزيئات عن طريق تحديد الحركة الحرارية للبروتينات المسماة بالفلورسنت استجابة لتدرج درجة الحرارة. يتم خلط جزيء الفلورسنت بتركيزات مختلفة من جزيئات الدهون غير الفلورية ، ويتم تحميل خليط الجزيئات في المحلول في الشعيرات الدموية. يتم تطبيق تدرج درجة الحرارة على العينات الموجودة في الشعيرات الدموية ، ويتم الكشف عن حركة جزيء الفلورسنت في تدرج درجة الحرارة وتسجيله.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد

1. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي هيدروكسيد_{هيدروكسيد 2}PO₄ ، و 2 ملي هيدروكلوريد هيدروكسيوم₂PO_{4 ،} درجة الحموضة 7.4.
2. تحضير صبغة NTA-Atto 647 N. قم بتخفيف صبغة NTA-Atto 647 N إلى 100 نانومتر من محلول DMSO بنسبة 100٪ إلى PBS بدون Tween.
3. Express Vam7-His8 - البروتين كبروتين اندماج في الإشريكية القولونية وتنقيته باستخدام Ni-NTA وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم.
4. معايرة المادة المراد تحليلها في المخزن المؤقت PBS. إذا كان التحليل في مخزن مؤقت مختلف ، فإن MST المسمى ليس حساسا بشكل خاص للاختل....

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Cy5 Maleimide صبغة أحادية التفاعل جنرال إلكتريك للرعاية الصحية PA23031 لوضع العلامات على البروتين منشور GraphPad برنامج GraphPad Monolith NT.115 الشعيرات الدموية (1000 عدد) نانوتمبير مو K022 الشعيرات الدموية ل MST آلة Monolith NT.115 نانوتمبير معدات الجامعة NTA-Atto 647 N سيغما 2175 تسمية لعلاماته فوسفاتيديلينوسيتول 3-فوسفات ديC8 (PI (3) P diC8) القياده ف - 3008 الدهون لتجارب الربط