الرحلان الحراري المجهري لدراسة تفاعلات البروتين والدهون في المحلول

الملخص

المصدر: Sparks، R. P. et al.، استخدام الرحلان الحراري المجهري لقياس تفاعلات البروتين والدهون.J. Vis. Exp.(2022)

يوضح هذا الفيديو الرحلان الحراري المجهري لدراسة التفاعل بين البروتين والدهون. يكتشف الاختبار التفاعل بين الجزيئات عن طريق تحديد الحركة الحرارية للبروتينات المسماة بالفلورسنت استجابة لتدرج درجة الحرارة. يتم خلط جزيء الفلورسنت بتركيزات مختلفة من جزيئات الدهون غير الفلورية ، ويتم تحميل خليط الجزيئات في المحلول في الشعيرات الدموية. يتم تطبيق تدرج درجة الحرارة على العينات الموجودة في الشعيرات الدموية ، ويتم الكشف عن حركة جزيء الفلورسنت في تدرج درجة الحرارة وتسجيله.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير المواد

1. تحضير محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS): 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي كلوريد كلوريد ، 10 ملي هيدروكسيد_{هيدروكسيد 2}PO₄ ، و 2 ملي هيدروكلوريد هيدروكسيوم₂PO_{4 ،} درجة الحموضة 7.4.
2. تحضير صبغة NTA-Atto 647 N. قم بتخفيف صبغة NTA-Atto 647 N إلى 100 نانومتر من محلول DMSO بنسبة 100٪ إلى PBS بدون Tween.
3. Express Vam7-His8 - البروتين كبروتين اندماج في الإشريكية القولونية وتنقيته باستخدام Ni-NTA وكروماتوغرافيا استبعاد الحجم.
4. معايرة المادة المراد تحليلها في المخزن المؤقت PBS. إذا كان التحليل في مخزن مؤقت مختلف ، فإن MST المسمى ليس حساسا بشكل خاص للاختلافات الطفيفة في المخزن المؤقت من الجزيئات مثل DMSO ، ما لم تتفاعل محتويات المخزن المؤقت المراد تحليله مع البروتين المسمى.

< p class = "jove_title" >2. تحضير جهاز MST

1. قم بتشغيل مفتاح الطاقة الموجود في الجزء الخلفي من الجهاز.
2. افتح برنامج التحكم وتأكد من أن الكمبيوتر المحمول قيد التشغيل وفي حالة الاتصال على الكمبيوتر المتصل بالجهاز.
3. أدخل إعدادات التألق و MST لهذه التجربة. اضبط MST قبل على 3 ثوان ، و MST إلى 30 ثانية ، واستعادة التألق (Fluo.)بعد 1 ثانية. قبل يقيس التألق الأولي ولا يتطلب وقتا طويلا ؛ MST هو مقدار الوقت الفعلي للوصول إلى التوازن بعد تحريض الحرارة.
4. جدول الشعيرات الدموية: لكل أنبوب شعري، أدخل اسم الهدف (الترابط)، واسم الترابط (المادة التحليلية)، وتركيز الهدف، وأعلى تركيز للمعايرة بالتحليل الحجمي واستخدم نسبة المعايرة بالتحليل الحجمي للملء التلقائي. على سبيل المثال ، أدخل 50 نانومتر للتركيز المستهدف ل Vam7-His8 ، Vam7-His8 للاسم المستهدف ، (1،2-حمض فوسفاتيديك ديوكتانويل) Di-C8 PA لاسم الترابط ، وأعلى تركيز للترابط الذي يختار 1: 1 والسحب لأسفل إلى فتحات الملء التلقائي 2-16.
5. قم بتشغيل Cap Scan لتحديد مؤشر LED المناسب (20٪ LED (الإعداد المسبق)) بناء على إشارة البروتين المستهدف واضبط ما بين 200 و 2000 وحدة مضان ل MST المسمى. يجب أن تظهر عمليات مسح الغطاء قمم مستديرة موحدة على شكل جرس.
6. حدد نطاقا من قوى MST وأدخل قيما لكل منها لاختبار أقوى ملاءمة ربط واضغط على Start Cap Scan + Measurement، ومسح قيم مختلفة لتحديد أفضل ظروف التشغيل للتفاعل المحدد الذي يتم اختباره.
7. حدد قوة MST بأفضل ملاءمة باستخدام برنامج التحليل والإعداد المسبق للرحلان الحراري باستخدام Tjump. تحليل النوبات وفقا لمعظم الفصل الفلوري بين أدنى وأعلى تركيز مقارنة بقوة MST مع أفضل ملاءمة وتحديد قوة MST لتكرار التجارب.
8. حدد ما إذا كان التبييض الضوئي قد حدث بين التشغيل الأول والثاني من خلال الانتقال إلى برنامج التحليل وتحويل التحليل إلى وضع الخبير. بعد ذلك ، حدد التألق بدلا من الرحلان الحراري للتحليل. حدد وضع الخبير ثم التبييض الضوئي.

< p class = "jove_title" >3. تحضير عينات ل MST المسمى

1. أحضر محلول Vam7-His8 إلى تركيز 200 نانومتر في PBS بدون Tween.
2. قم بإحضار صبغة NTA-Atto 647 إلى 100 نانومتر في PBS بدون Tween.
3. امزج صبغة Vam7-His8 و NTA-Atto 647 بنسبة حجمية 1: 1 واتركها في درجة حرارة الغرفة مغطاة بالضوء لمدة 30 دقيقة. حدد التركيز المناسب للبروتين المستهدف كما في القسم 2.5 (انظر الملحق الخاص باستخدام KD من صبغة Ni-NTA كما هو موضح في الفيديو).
4. خليط أجهزة الطرد المركزي من صبغة NTA-Atto 647 N والبروتين لمدة 10 دقائق في غرفة مظلمة باستخدام جهاز طرد مركزي منضدي بحوالي 8,161 × جم.
5. قم بتخزين الخليط في درجة حرارة 4 درجات مئوية بعد التجربة أو على الثلج أثناء التجربة لإعادة استخدامه في غضون ساعات قليلة إذا لزم الأمر لمنع البروتين من التمسخ.
6. استخدم مكتشف تركيز NT لتحديد نطاق التركيز اللازم للمعايرة بالتحليل الحجمي.
7. قم بإحضار Di-C8 PA إلى أقصى تركيز مناسب في الماء.
8. معايرة المادة المراد تحليلها باستخدام التخفيف التسلسلي 1: 1 في المخزن المؤقت PBS ل 16 تركيزا بناء على الخطوة السابقة. على عكس SPR ، فإن الرحلان الحراري ليس حساسا للاختلافات في المخزن المؤقت.

فئة

4. MST للعينات

1. قم بتشغيل الجهاز والكمبيوتر المحمول المرفق.
2. اضغط على السهم لأعلى في مقدمة الماكينة وحرك الرف الشعري للخارج.
3. قم بتحميل الشعيرات الدموية في الحامل بأعلى تركيز في الموضع 1.
4. في برنامج التحكم، حدد القناة الحمراء المقابلة ل NTA-Atto 647 N.
5. أدخل معلومات التركيز والموضع والاسم لكل شعيرات الدموية في جدول الشعيرات الدموية.
6. قم بإجراء فحص شعري عن طريق الضغط على Start Cap Scan بنسبة 20٪ LED (الإعداد المسبق) واضبطه وفقا لذلك بين 200 و 2000 وحدة مضان باستخدام إعدادات شدة LED أو تركيز الترابط (البروتين المسمى).
7. حدد نطاقا من طاقة MST.
8. بدء مسح الغطاء + قياس MST.
9. التحليل باستخدام برنامج التحليل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات Cy5 Maleimide صبغة أحادية التفاعل جنرال إلكتريك للرعاية الصحية PA23031 لوضع العلامات على البروتين منشور GraphPad برنامج GraphPad Monolith NT.115 الشعيرات الدموية (1000 عدد) نانوتمبير مو K022 الشعيرات الدموية ل MST آلة Monolith NT.115 نانوتمبير معدات الجامعة NTA-Atto 647 N سيغما 2175 تسمية لعلاماته فوسفاتيديلينوسيتول 3-فوسفات ديC8 (PI (3) P diC8) القياده ف - 3008 الدهون لتجارب الربط