مقالة منهجية

قياس التدفق الخلوي الكمي لدراسة تفاعلات حويصلة البروتين والفوسفوليبيد المسمى

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Podoplelova ، N. et al. ، تحليل تفاعل البروتينات المسماة بالفلورسنت مع الحويصلات الدقيقة الفوسفوليبيد الاصطناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي. J. Vis. Exp. (2022)

في هذا الفيديو ، نوضح التفاعل بين البروتينات وحويصلات الفوسفوليبيد الاصطناعية باستخدام قياس التدفق الخلوي الكمي. يؤدي ارتباط البروتينات ذات العلامات الفلورية بحويصلات الفوسفوليبيد ذات العلامات الفلورية إلى زيادة متوسط شدة التألق ، ويتم الكشف عن هذه الزيادة بواسطة مقياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. الكشف عن تفاعل البروتين والدهون عن طريق قياس التدفق الخلوي

  1. تجارب الربط الحركي
    1. تمييع حويصلات الفوسفوليبيد في عازلة تيرود (20 ملي مولار HEPES ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد كلوريد ، 1 ملي مللي كلوريد2 ، 0.4 ملي مولار هيدروهيدروشميد2PO4 ، 2.5 ملي كلوريد الكاليوم2 ، 5 ملي مولار جلوكوز ، 0.5٪ BSA ، درجة الحموضة 7.4) إلى تركيز 1 ميكرومتر والحجم الإجمالي 250 ميكرولتر.
    2. امزج عامل التخثر X المسمى بالفلورسنت (fX-fd) من الخطوة 1 بتركيز 500 نانومتر مع حويصلات الفوسفوليبيد من الخطوة 1.1.1 بنسبة 1: 1 (تركيز الحويصلة النهائي 0.5 ميكرومتر ، تركيز fX-fd هو 250 نانومتر من fX) إلى الحجم الإجمالي 500 ميكرولتر.
      3. قم
    3. بحقن 500 ميكرولتر على الفور من التعليق المختلط (~ 20 دقيقة للتحليل بمعدل تدفق منخفض) في مقياس التدفق الخلوي. استخدم معدل تدفق منخفض وتأكد من أن عتبة القناة FL2 (الإثارة 488 نانومتر، مرشاح الانبعاث 585/42 نانومتر) هي القيمة 200. قم بقياس متوسط التألق في القناة FL4 (الإثارة 633 نانومتر ، مرشح الانبعاث 660/20) لصبغة التألق من جدول المواد.
      ملاحظه: اختر مقياس خلوي بدون جهاز أخذ العينات التلقائي. سيؤدي ذلك إلى تسريع عملية حقن العينة في خلية القياس.
    4. عندما يتحقق تشبع الارتباط (لا توجد زيادة كبيرة في التألق في غضون 5 دقائق) ، قم بتخفيف العينة بسرعة 20 ضعفا باستخدام المخزن المؤقت ل Tyrode ، وراقب التفكك حتى يتم الوصول إلى مضان خط الأساس (التفكك الكامل) أو حتى يتم الوصول إلى الهضبة (لا يوجد انخفاض كبير في التألق في غضون 5 دقائق).
      ملاحظه: كعنصر تحكم ، أضف 10 ميكرومتر EDTA وراقب التفكك الكامل لمدة 5 دقائق.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أليكسا فلور 647 NHS إستر (Succinimidyl Ester) ثيرمو فيشر العلمي أ37573 صبغة الفلورسنت BD FACSCantoII BD Bioscience DiIC16 (3) (1،1 '-ثنائي هيكساديسيل-3،3،3 '، 3'-تتراميثيلإندوكاربوسيانين بيركلورات) ثيرمو فيشر العلمي د384 صبغة الفلورسنت DMSO سيجما ألدريتش د8418 هيبس سيجما ألدريتش H4034-500G L-α-فوسفاتيديل سيرين (الدماغ والخنازير) (ملح الصوديوم) أفانتي بولر ليبيدس 840032 ص L-α-فوسفاتيديل كولين (الدماغ ، الخنازير) أفانتي بولر ليبيدس 840053 ف الطارد الصغير أفانتي بولر ليبيدس 610020-1 أ كلوريد البوتاسيوم سيجما ألدريتش ب 9541-500 جرام كلوريد الكالسيوم ، اللامائي ، مسحوق ، ≥97٪ سيجما ألدريتش C4901-100G فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة سيجما ألدريتش S3139-250G كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش S3014-500G كلوريد المغنيسيوم سيجما ألدريتش M8266-100G ألبومين مصل الأبقار VWR علوم الحياة أمريسكو Am-O332-0.1 ملح ثنائي الصوديوم EDTA VWR علوم الحياة أمريسكو AM-O105B-0.1

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة