ملاحظة: يجب تصفية المخازن المؤقتة باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر وتفريغها بواسطة فراغ لمدة 1 ساعة.
< p class = "jove_title" >
1. تحضير الحويصلة الدهنية
- استخدم أنابيب زجاجية سعة 2 مل. قم بإذابة كل دهون ، 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) ، 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (POPC) ، 1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) ، والكوليسترول (Chol) ، في خليط من الكلوروفورم / الميثانول (50:50 فولت / حجم) لتحضير محلول دهني واضح 5 ملليمتر. قم بإذابة 1،2-dioleoyl-sn-glycero-3-phospho- (1'-myo-inositol-4'، 5'-bisphosphate) (PI (4،5) P2) في خليط من الكلوروفورم / الميثانول / الماء (20: 9: 1 v / v).
- اجمع بين الدهون الذائبة في النسبة المولية المطلوبة من POPC / POPS (80/20) ، POPC / PI (4،5) P2 (95/5) ، POPC / POPS / Chol (60/20/20) ، POPC / POPS / PI (4،5) P2 / Chol (60/17/3/20) ، و POPC / DOPC / POPS / PI (4،5) P2 / Chol (37/20/20/3/20) (الجدول 1) في أنابيب زجاجية سعة 10 مل.
ملاحظه: الكمية النهائية من إجمالي الدهون هي 500 ميكروغرام.
- تبخر المذيبات العضوية باستخدام تيار جاف من النيتروجين. اترك خليط الدهون على نظام فراغ عالي (تجفيد بالتجميد) لمدة 3 ساعات لإزالة أي آثار متبقية للمذيبات.
ملاحظه: ينتج عن هذا فيلم جاف وشفاف.
- أعد تعليق الطبقة الدهنية في 1 مل من عازلة السترات (10 ملي تريسوديوم سترات ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 4.6). احتضان معلق الدهون عند 60 درجة مئوية (درجة الحرارة هذه أعلى بحوالي 10 درجات مئوية من درجة حرارة انتقال الطور لأعلى دهون ذوبان في الخليط) لمدة 30 دقيقة في حمام مائي ، وقم بدوامته بقوة كل 5 دقائق><.
ملاحظه: ينتج عن هذا تكوين حويصلات كبيرة متعددة الصفائح (MLVs). حافظ على التعليق فوق درجة حرارة الانتقال.
- قم بتسخين الطارد (عند 60 درجة مئوية في هذه الحالة) المجهز بغشاء بولي كربونات بحجم المسام بقطر 50 نانومتر فوق درجة حرارة الانتقال (وهي 40-50 درجة مئوية هنا) لمدة 30 دقيقة.
- قم بتحميل نظام التعليق MLV في الطارد المسخن مسبقا وقم بتمرير الخليط برفق 31x عبر غشاء البولي كربونات لتشكيل حويصلات أحادية الصفيحة صغيرة (SUVs). حافظ على درجة الحرارة أعلى من درجة الحرارة الانتقالية.
- انقل نظام التعليق SUV إلى وعاء تفاعل بلاستيكي سعة 2 مل وأضف عازلة السترات (انظر الخطوة 1.4) لرفع الحجم النهائي إلى 2 مل.
ملاحظه: سينتج عن ذلك تركيز دهني نهائي يبلغ 250 ميكروغرام / مل.
< p class = "jove_title" >
2. التعامل مع مستشعرات الكوارتز
ملاحظة: تعامل دائما مع مستشعرات الكوارتز باستخدام الملقط.
- احتضن أربعة مستشعرات يتم إدخالها في حامل بولي تترافلورو إيثيلين في محلول SDS بنسبة 2٪ لمدة 30 دقيقة ≥. اغسلها على نطاق واسع بالماء فائق النقاء لإزالة SDS تماما واتركها تجف باستخدام تيار من الأرجون الجاف أو النيتروجين.
- استخدم نظام تنظيف البلازما لإزالة أي ملوثات تماما. أدخل المستشعرات الجافة في غرفة تنظيف البلازما ، وأخرج الغرفة ، واغسلها 3 مرات بالأكسجين. قم بتشغيل منظف البلازما. استخدم معلمات العملية التالية: 1 × 10-4 ضغط Torr ، وطاقة تردد الراديو العالي (RF) ، و 10 دقائق من وقت العملية. قم بإيقاف تشغيل الجهاز وإخراج المستشعرات.
فئة
3. عملية التوازن الدقيق
ملاحظة: تم استخدام نظام موازنة دقيقة مع أربع غرف تدفق يتم التحكم في درجة حرارتها في تكوين متوازي ، متصلة بمضخة تمعجية ومضبوطة على معدل تدفق يبلغ 80 ميكرولتر / دقيقة. في وضع التدفق المفتوح ، تم ضخ المخزن المؤقت من خزان التغذية إلى خزان الاستقبال. في وضع الحلقة ، تم توصيل خزان الاستقبال بخزان التغذية لإنشاء حلقة مغلقة. تم ضبط درجة الحرارة على 20 درجة مئوية.
- قم بإرساء المستشعرات التي تم تنظيفها بالبلازما بعناية في 4 غرف تدفق باستخدام ملاقط. تجنب أي ضغط أو التواء على الغرف والأنابيب التي قد تسبب التسرب.
- اغسل النظام بمخزن مؤقت للسترات (10 ملي مولار ثلاثي الصوديوم سترات ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 4.6) في وضع التدفق المفتوح لمدة 10 دقائق < br / >
ملاحظه: يتطلب هذا بالضبط 3.2 مل من المخزن المؤقت ، ولكن ينصح باستخدام مخزن مؤقت زائد (10 مل).
- قم بتشغيل البرنامج. ابدأ في تسجيل أي تغييرات في تردد وتبديد النغمة الأساسية الأولى (ن = 1st) والنغمات (n = 3rd - 13th) باستخدام البرنامج ، حتى تصبح خطوط الأساس للتردد والتبديد مستقرة (سيستغرق ذلك حوالي 40 - 60 دقيقة).
ملاحظه: وينبغي أن تكون سويات ضوضاء التردد (من الذروة إلى الذروة) أقل من Hz 0,5، وبالنسبة للتبديد، أقل من 0.1·10-6، مع انجراف أقصى (في محلول مائي) يبلغ تردده Hz/h 1 و0.3·10-6/ساعة في التبديد.
- عندما تكون خطوط الأساس مستقرة ، قم بتطبيق نظام تعليق سيارات الدفع الرباعي في عازلة السترات (2 مل في أنبوب صغير). باستخدام وعاء التفاعل ، قم بإزالة 1.5 مل من الحجم الميت. ثم أغلق النظام في وضع تدفق الحلقة. سجل تحول التردد / التبديد لمدة 10 دقائق أخرى.
ملاحظه: خلال هذا الوقت ، ستنتشر الحويصلات على سطح SiO2 وتندمج لتشكيل طبقة ثنائية مستمرة (الخطوة 2 في الأشكال 1 والشكل 2 والشكل 3). امتصاص سيارات الدفع الرباعي على سطح المستشعر ثنائي الطور وله حد أدنى وأقصى للتردد النموذجي في التبديد. يشير خط الأساس الجديد المستقر للتردد / التبديد مع تحول تردد مميز (اعتمادا على تكوين الدهون) من 26 - 29 هرتز (انظر الجدول 1) إلى طبقة ثنائية مستمرة على السطح.
- عندما يكون SLB مستقرا (انظر الخطوة 3.4) ، قم بموازنة النظام مع المخزن المؤقت قيد التشغيل (10 ملي مولار HEPES ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.4) عند تركيزات Ca2+ المطلوبة (تتراوح من 50 ميكرومتر إلى 1 ملي مولار CaCl2 ، اعتمادا على التجربة) في وضع التدفق المفتوح لمدة 40 دقيقة.
- أضف البروتين (هنا ، AnxA2) إلى المخزن المؤقت قيد التشغيل الذي يحتوي على Ca2+ (انظر الخطوة 3.5). قم بإجراء تطبيق البروتين في وضع التدفق الحلقي حتى يتم الوصول إلى حالة استقرار التوازن (الخطوة 3 في الشكل 1 والشكل 2 والشكل 3).
ملاحظه: قد يتراوح تركيز البروتين من 1 إلى 400 نانومتر. ينتج عن امتصاص البروتين تحول تردد يعتمد على التركيز يعكس امتصاص الكتلة (البروتين).
- قم بفصل البروتين المرتبط عن طريق مخلب أيونات Ca2 + مع 5 ملي مولار EGTA في المخزن المؤقت الجاري في وضع التدفق المفتوح (الخطوة 4 في الشكلين 1 والشكل 2).
ملاحظه: يشير استرداد التردد والتبديد إلى خط الأساس SLB إلى الانعكاس الكلي لارتباط البروتين. يمكن تكرار دورات الارتباط والتفكك لمقارنة التركيزات أو البروتينات المختلفة.
