$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. تصوير تكوين التكثيف EWS-FLI1 على ستائر الحمض النووي
- افتح برنامج التصوير ، وابحث عن مواضع الأنماط المتعرجة 3 × 3 تحت المجال الساطع وقم بتمييزها.
- قم بتشغيل التدفق بسرعة 0.2 مل / دقيقة لتلطيخ الحمض النووي بصبغة الحمض النووي مزدوجة الشريطة لمدة 10 دقائق.
- تمييع mCherry-EWS-FLI1 مع المخزن المؤقت للتصوير بتركيز 100 نانومتر في 100 ميكرولتر في الأنبوب.
- قم بتحميل عينة البروتين عبر الصمام بحقنة زجاجية سعة 100 ميكرولتر ، وقم بتغيير معدل التدفق إلى 0.4 مل / دقيقة.
- قم بتشغيل ليزر 488 نانومتر وقم بمسح كل منطقة مسبقا للتحقق من حالة توزيع الحمض النووي ؛ حدد المنطقة التي تتوزع فيها جزيئات الحمض النووي بالتساوي. اضبط طاقة الليزر على 10٪ لليزر 488 نانومتر و 20٪ لليزر 561 نانومتر. استخدم مقياس الطاقة لقياس طاقة الليزر الحقيقية بالقرب من المنشور: 4.5 ميجاوات لليزر 488 نانومتر و 16.0 ميجاوات لليزر 561 نانومتر.
- الحصول على الصور
- ابدأ في الحصول على الصور على فترات 2 ثانية مع كل من ليزر 488 نانومتر و 561 نانومتر في وقت واحد.
- قم بتغيير الصمام من وضع الحقن اليدوي إلى وضع الحقن للسماح للمخزن المؤقت للتصوير بغسل عينة البروتين إلى خلية التدفق بعد 60 ثانية < / >
ملاحظه: ستستغرق هذه العملية ~ 30 ثانية ، وسيتم تغطية مجال الرؤية بإشارات mCherry بمجرد وصول بروتينات EWS-FLI1 إلى خلية التدفق.
- لإزالة EWS-FLI1 المجاني، استمر في غسل خلية التدفق باستخدام المخزن المؤقت للتصوير لمدة 5 دقائق مع تشغيل ليزر 561 نانومتر فقط. أوقف التدفق واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- قم بتشغيل التدفق بسرعة 0.4 مل / دقيقة للسماح للحمض النووي بالتمدد ، والحصول على صور على فترات 2 ثانية بين الإطارات المختلفة للحصول على بيانات عالية الإنتاجية لتكوين المكثفات EWS-FLI1.
< p class = "jove_title" >
2. تحليل الشدة ل mCherry-EWS-FLI1
- قم باستيراد البيانات كتسلسلات صور إلى برنامج ImageJ ، واختر النقاط في 25× مواقع GGAA في مربع 8×8 بكسل ، واحفظ الصورة بتنسيق .tif.
- احسب الشدة كمجموع للشدة في مربع 8×8 بكسل ، بما في ذلك النقطة الكاملة ، وقم بإزالة الخلفية عن طريق طرح شدة الخلفية في منطقة من نفس الحجم بالقرب من مربع 8 × 8 بكسل.