مقالة منهجية

مقايسة تعديل الأس الهيدروجيني على الطبقات الدهنية الثنائية المدعومة للكشف عن تفاعلات البروتين والفوسفوينوزيتيد

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Shengjuler ، D. ، et al. ، PIP-on-a-chip: دراسة خالية من الملصقات لتفاعلات البروتين والفوسفوينوزيتيد. J. Vis. Exp. (2017)

في هذا الفيديو ، نوضح تفاعلات البروتين والفوسفوينوسيتيد في نمط ميكروسويديك باستخدام مقايسة تعديل الأس الهيدروجيني ، باستخدام صبغة الفلورسنت الحساسة للأس الهيدروجيني الموسومة بالدهون الفوسفاتيديلة إيثانولامين لطبقة ثنائية الدهون المدعومة ، تسمى منصة الموائع الدقيقة. تتسبب التعديلات في الأس الهيدروجيني بعد ارتباط البروتين بالفوسفوليبيد في تبريد التألق.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. تشكيل طبقات الدهون الثنائية المدعومة (SLBs)

  1. انقل 100 ميكرولتر من سيارات الدفع الرباعي المحتوية على PI (4،5) P2 إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 0.65 مل. اضبط الرقم الهيدروجيني للمحلول على ~ 3.2 بإضافة 6.4 ميكرولتر من 0.2 نيوتن حمض الهيدروكلوريك.
    ملاحظه: تأكد من الرقم الهيدروجيني للمحلول باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني المجهز بمسبار الأس الهيدروجيني الصغير (انظر جدول المواد).
  2. ماصة 10 ميكرولتر من محلول الدفع الرباعي المعدل بدرجة الحموضة في كل قناة عبر المدخل والضغط عبر الماصة حتى يصل المحلول إلى المخرج. افصل الطرف عن الماصة واتركه متصلا بالجهاز.
  3. كرر الخطوة المذكورة أعلاه لكل قناة ثم احتضن الجهاز لمدة 10 دقائق في RT.
    ملاحظه: يجب إجراء حقن الحويصلات في القنوات الدقيقة مباشرة بعد تجميع الجهاز.
  4. قطع مجموعات من أنابيب المدخل والمخرج كل منها 60 سم (أنبوب مدخل) و 8 سم (أنبوب المخرج) ، على التوالي.
    ملاحظه: قطع الأنبوب قطريا وإنشاء حافة حادة ، يجعل من السهل إدخال الأنبوب في المداخل والمنافذ. يجب أن يكون لأنبوب المخرج شكل قوس. قد يختلف طول أنبوب المدخل بناء على إعداد المجهر. القطر الداخلي للأنبوب 0.05 سم.
  5. باستخدام الملقط ، قم بتوصيل مجموعة أنبوب المخرج بالجهاز ، ثم قم بلصق الجهاز على مرحلة المجهر.
  6. اغمر أحد طرفي أنبوب المدخل في 25 مل من المخزن المؤقت الموجود في أنبوب مخروطي الشكل وقم بلصقه للتأكد من تأمين الأنبوب.
  7. ضع الأنبوب المخروطي على أرض أعلى (~ 20 سم) من الجهاز من أجل دفع المحلول عبر القنوات الدقيقة عبر تدفق الجاذبية ؛ يمكن استخدام مقبس المختبر لتحقيق ذلك.
  8. لكل أنبوب مدخل ، استخدم حقنة لسحب 1 مل من المخزن المؤقت الجاري من الطرف الحر للأنبوب. قم بإزالة طرف الماصة من المدخل وأدخل الطرف الحر لأنبوب المدخل في الجهاز.
    ملاحظه: أدخل قطرة من المخزن المؤقت الجاري على المدخل لتقليل احتمالية إدخال فقاعة هواء في القناة أثناء هذه الخطوة. بعد توصيل أنبوب المدخل بالجهاز ، استخدم منديلا خاليا من النسالة لإزالة المخزن المؤقت الزائد.
  9. كرر الخطوة المذكورة أعلاه لتوصيل جميع قطع أنابيب المدخل بالجهاز.
    ملاحظه: يساعد المخزن المؤقت المتدفق عبر القنوات على إزالة الحويصلات الزائدة وتوازن الطبقة الثنائية مع الظروف التجريبية.
  10. افتح برنامج التحكم في المجهر (انظر جدول المواد). في اللوحة اليسرى ، انقر فوق علامة التبويب "المجهر" واختر الهدف "10X".
  11. انقر فوق أيقونات الصور "Live" ثم "Alexa 568" على شريط الأدوات. باستخدام مقابض ضبط المسار الدقيقة ، ركز على القنوات الدقيقة.
  12. امسح ضوئيا من خلال الجهاز للتحقق من جودة SLBs والقنوات (الشكل 1). ثم انقر فوق رمز الصورة "FL Shutter Closed" على شريط الأدوات.
  13. انقر فوق علامة التبويب "اكتساب" ، وضمن "التعديلات الأساسية" حدد "وقت التعرض". اضبط وقت التعرض على "200 مللي ثانية".
  14. في اللوحة اليسرى ، انقر فوق "اكتساب متعدد الأبعاد" وتحت قائمة المرشحات حدد القناة الحمراء (المميزة باسم "Alexa 568"). ثم انقر فوق قائمة "الفاصل الزمني" ، واضبط الفاصل الزمني على 5 دقائق ، والمدة على 30 دقيقة ، وانقر فوق "ابدأ".
    ملاحظه: بناء على المدة (30 دقيقة) ومعدل التدفق (~ 1.0 ميكرولتر / دقيقة) ، يتم استخدام 30 ميكرولتر من المخزن المؤقت قيد التشغيل لموازنة SLB داخل قناة ، أي يتم استخدام 240 ميكرولتر من المخزن المؤقت قيد التشغيل لجميع القنوات الثمانية.
  15. حدد أداة "الدائرة" ضمن علامة التبويب "قياس" وارسم دائرة في أي قناة. انقر بزر الماوس الأيمن أثناء تحديد الدائرة واختر "خصائص". ضمن علامة التبويب "الملف الشخصي" ، حدد "كل T" لعرض شدة التألق كدالة للوقت.
    1. تأكد من وصول هذا المنحنى إلى هضبة ، مما يشير إلى التوازن ، قبل الانتقال إلى الخطوة التالية.
  16. اخفض محلول المخزن المؤقت إلى أرض متساوية مثل الجهاز لإيقاف التدفق.
  17. احفظ ملف الفاصل الزمني.

2. اختبار تفاعل مجال PLC-δ1 PH مع SLBs المحتوية على PI (4،5) P2

  1. إعداد تخفيفات مجال PH باستخدام المخزن المؤقت قيد التشغيل كمخفف.
    ملاحظه: نظرا لوجود ثماني قنوات داخل الجهاز ، استخدم اثنتين منها على الأقل لعناصر التحكم الفارغة. اختر الأطراف البعيدة على كل جانب واستخدم القنوات المتبقية لتخفيف البروتين. تم اختبار تركيزات مجال الأس الهيدروجيني التالية: 0.10 و 0.25 و 0.50 و 1.00 و 2.50 ميكرومتر. كان ما يقرب من 200 ميكرولتر من كل تخفيف كافيا للوصول إلى التوازن في غضون 30 دقيقة.
  2. افصل كل أنبوب مخرج واحدا تلو الآخر وقم بتطبيق 200 ميكرولتر من كل تخفيف بروتين في قناة المخرج باستخدام ماصة. لا تمارس أي ضغط ، دع الجاذبية تقوم بالعمل. افصل الطرف عن الماصة واتركه متصلا بجهاز الموائع الدقيقة.
  3. كرر الخطوة المذكورة أعلاه لكل قناة وتأكد من عدم إدخال فقاعات الهواء في القنوات أثناء هذه العملية.
  4. اخفض أنبوب المدخل إلى الأرض أسفل جهاز الموائع الدقيقة لبدء تدفق البروتين عبر القنوات الدقيقة. قم بلصق الطرف الحر للأنبوب في حاوية نفايات. تدفق تخفيفات البروتين لمدة 30 دقيقة < / > ملاحظه: سيؤدي ذلك إلى عكس التدفق والسماح بإدخال البروتين في القنوات. سيعتمد وقت التوازن وحجم تخفيفات البروتين المطلوبة على تقارب التفاعل.
  5. في اللوحة اليسرى من البرنامج ، ضمن علامة التبويب "الفاصل الزمني" ، انقر فوق "ابدأ" لبدء التصوير مرة أخرى.
  6. عند اكتمال التجربة، احفظ ملف الفاصل الزمني.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >figure-results-1
الشكل 1: تقييم سلامة SLBs والقنوات الدقيقة. (أ) صورة توضح SLBs والقنوات الصغرى عالية الجودة. (ب) الاندماج غير المكتمل. (ج) القنوات الدقيقة المنصهرة. (د) جزيئات الغبار المحاصرة داخل قناة صغيرة. (ه) فقاعات الهواء المحبوسة داخل القنوات الدقيقة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1-بالميتويل -2-أوليويل SN-جلسيرو -3-فوسفوكولين أفانتي بولر ليبيدس 850457 ج POPC L-α-فوسفاتيديلينوسيتول-4-فوسفات أفانتي بولر ليبيدس 840045X PI4P L-α-فوسفاتيديلينوسيتول-4،5-ثنائي الفوسفات أفانتي بولر ليبيدس 840046X PI (4،5) P2 1-بالميتويل -2-أوليويل-SN-جلسيرو-3-فوسفويثانولامين أفانتي بولر ليبيدس 850757ج بابا; مطلوب لتخليق oSRB-POPE كلوريد السلفونيل الليزامين رودامين ب (أيزومرات مختلطة) ثيرموفيشر العلمي L-20 مطلوب لتخليق oSRB-POPE مسبار الدهون الفلورية الحساسة للأس الهيدروجيني (oSRB-POPE) داخلي غير متاح التوليف الداخلي (Huang D. et al. 2013) مجهر Axiovert 200M epifluorescence الفحص المجهري لكارل زايس غير متاح مجهر كاميرا AxioCam MRm الفحص المجهري لكارل زايس غير متاح كاميرا إكس كايت 120 تقنيات إكسليتاس غير متاح مصدر الضوء مجموعة مرشحات Alexa 568 الفحص المجهري لكارل زايس غير متاح Ex / Em 576/603 نانومتر برنامج AxioVision LE64 v.4.9.1.0 الفحص المجهري لكارل زايس غير متاح برامج معالجة الصور النصائح VWR 10034-132 200 طرف ماصة لكل بوصة مربعة ؛ طرف رفيع وسلس لتطبيق محلول البروتين في قناة الموائع الدقيقة النصائح VWR 53509-070 10 أطراف ماصة uL ؛ طرف رفيع وسلس لتطبيق محلول الحويصلة في قناة الموائع الدقيقة مقياس الأس الهيدروجيني Orion Star A321 الترمو: العلمية STARA3210 مقياس الأس الهيدروجيني مسبار Orion micro pH الترمو: العلمية 8220 بي إن وبس مسبار الأس الهيدروجيني الجزئي N- (2-هيدروكسي إيثيل) - بيبيرازين - ن '- (2-حمض الإيثان سلفونيك) VWR VWRB30487 HEPES ، حمض خال كلوريد الصوديوم VWR BDH8014-2.5 كيلو غرام كلوريد الصوديوم انابيب الأسلاك والكابلات المتحالفة TFT-200-24 N القطر الداخلي: 0.020-0.026 بوصة (0.051-0.066 سم) ؛ سمك الجدار: 0.010 بوصة (0.025 سم); أنابيب مرنة من البولي تترافلورو إيثيلين رقيقة الجدار. لون طبيعي غاز النيتروجين - صناعي براكساير غير متاح مزود محلي غاز الأكسجين - صناعي براكساير غير متاح مزود محلي النيتروجين السائل براكساير غير متاح مزود محلي

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

C 4 5

مقالات ذات صلة