التحليل الطيفي الكمي للهيدروجين داخل الخلية بالرنين المغناطيسي النووي لمراقبة تفاعلات البروتين والترابط

الملخص

المصدر: Barbieri، L. et al.، مراقبة تفاعلات البروتين والترابط في الخلايا البشرية عن طريق الرنين المغناطيسي النووي الكمي في الخلية في الوقت الفعلي باستخدام مفاعل حيوي عالي الكثافة للخلايا.J. Vis. Exp.(2021)

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية لدراسة تفاعلات البروتين والترابط بين البروتينات غير المسماة والجزيئات الصغيرة. يتم تأكيد التفاعل الناجح بين البروتين الرابطي بصريا من خلال ظهور مجموعة إضافية من القمم في المنطقة الطيفية ذات الأهمية التي تحل تدريجيا محل القمم الأصلية.

البروتوكول

1. إعداد الكاشف والحل

1. لتحضير DMEM كامل، أضف 5 مل من L-glutamine 200 mM و 5 مل من البنسلين والستربتومايسين 100x و 50 مل من مصل الأبقار الجنينية (FBS، التركيز النهائي 10٪/vol) إلى 440 مل DMEM.
   ملاحظه: يمكن تخزين هذا المحلول عند 4 درجات مئوية لمدة شهر واحد.
2. تحضير محلول الاغاروز عن طريق إذابة 150 مجم من الاغاروز منخفض التبلور في 10 مل من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) عند 85 درجة مئوية للحصول على محلول 1.5٪ (وزن / حجم). تعقيم بالترشيح باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر. تحضير 1 مل من محلول الاغاروز في 1.5 نيوتن
3. تحضير وسط المفاعل الحيوي.
   1. قم بإذابة 13.4 جم من مسحوق DMEM في 1 لتر من H₂O.
      ملاحظه: اعتمادا على التطبيق ، قد يختلف الحجم النهائي المطلوب (على سبيل المثال ، بالنسبة لوسط 500 مل ، قم بإذابة 6.7 جم من المسحوق في 500 مل H₂O).
   2. أضف 2٪ FBS ، و 10 ملي NaHCO₃ ، و 1x البنسلين - الستربتومايسين (100x) ، و 2٪ D₂O (على سبيل المثال ، بالنسبة لوسط 500 مل ، أضف 10 مل من FBS ، و 0.4 جم من NaHCO₃ ، و 5 مل من البنسلين - الستربتومايسين 100x ، و 10 مل من D₂O).
   3. قم بقياس الأس الهيدروجيني باستخدام مقياس الأس الهيدروجيني وإذا لزم الأمر ، اضبطه على 7.4 بإضافة HCl.
      ملاحظه: عادة ما يكون الرقم الهيدروجيني الأولي قريبا جدا من 7.4.
   4. قم بتصفية وسط المفاعل الحيوي باستخدام مرشح معقم يعمل بالفراغ في زجاجة زجاجية معقمة سعة 250 مل أو 500 مل.
   5. في غطاء التدفق الصفحي ، أغلق الزجاجة بغطاء رأس فولاذي معقم مع فوهتين للخرطوم وقم بتوصيلها بأنبوب FEP (OD = 1/8 "، i.d. = 1.6 مم) سيتم توصيله بالمضخة وبفلتر حقنة PTFE 0.22 ميكرومتر لسحب الهواء.

< p class = "jove_title" >2. إعداد Bioreactor

1. قم بتجميع وحدة التدفق باستخدام وحدة التدفق الثانية أنبوب الرنين المغناطيسي النووي ، والذي سيتم استبداله لاحقا بالأنبوب الذي يحتوي على الخلايا. راجع تعليمات تشغيل وحدة التدفق للتجميع الصحيح.
   ملاحظه: في هذه المرحلة ، يجب تنظيف وحدة التدفق بالفعل (إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتنفيذ الخطوة 4.2).
2. اضبط الحمام المائي المتصل بوحدة التحكم في درجة حرارة وحدة التدفق على 37 درجة مئوية. ضع زجاجة الخزان في الحمام المائي.
3. قم بتوصيل أنبوب FEP لزجاجة الخزان بالمضخة.
4. أدر صمام المفاعل الحيوي إلى "الالتفاف" واملأ المضخة مسبقا بوسيط.
5. أدر صمام المفاعل الحيوي إلى "التدفق" واملأ المفاعل الحيوي مسبقا بالوسط بسرعة 0.1 مل / دقيقة.

< p class = "jove_title" >3. تحضير عينة الخلية

1. اجمع الخلايا من حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂.
   1. خذ قارورة T75 من خلايا HEK293T المنقولة من حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ وقم بإزالة الوسط المستهلك.
   2. اغسل الخلايا مرتين ب 7 مل (لكل منهما) من PBS في درجة حرارة الغرفة (~ 20 درجة مئوية).
   3. استخدم 2 مل من التربسين / EDTA لفصل الخلايا. بعد إضافة المحلول ، احتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لفصل الخلايا.
      ملاحظه: قد تستغرق الخلايا المنقولة وقتا أطول قليلا حتى تنفصل. إذا لزم الأمر ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية.
   4. قم بتعطيل التربسين مع 20 مل من DMEM الكامل ؛ قم بإعادة تعليق الخلايا تماما عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ونقلها في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل.
   5. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية.
   6. اغسل الخلايا ب 10 مل من PBS في درجة حرارة الغرفة لإزالة الوسط المتبقي.
   7. قم بالطرد المركزي للخلايا عند 800 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتخلص من المادة الطافية.
   8. انقل حبيبات الخلية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مغطى بسعة 1.5 مل.
2. تضمين الخلايا في خيوط الاغاروز.
   1. قم بإذابة قطعة واحدة من الاغاروز المتصلب عند 85 درجة مئوية في حمام مائي ثم احتفظ بها في محلول عند 37 درجة مئوية في سخان كتلة.
   2. باستخدام ماصة باستور ، املأ الجزء السفلي من أنبوب الرنين المغناطيسي النووي لوحدة التدفق ب 60-70 ميكرولتر من هلام الاغاروز 1.5٪ وضعه في الثلج. سيؤدي ذلك إلى إنشاء قابس سفلي بارتفاع ~ 5 مم يسمح بوضع عينة الخلية داخل الحجم النشط لملف الرنين المغناطيسي ^{النووي 1}ساعة.
   3. قم بتسخين حبيبات الخلايا التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.1.8 عند 37 درجة مئوية لمدة 15-20 ثانية في الكتلة الحرارية.
   4. أعد تعليق الخلايا في 450 ميكرولتر من محلول الاغاروز. احرص على تجنب تكوين الفقاعات.
   5. استنشق معلق الخلية الاغاروز في أنبوب نظرة خاطفة كروماتوغرافيا بطول ~ 30 سم (معرف = 0.75 مم) متصل بحقنة 1 مل. < / > ملاحظه: قبل الشفط ، يجب ملء الأنبوب والحجم الميت للحقنة مسبقا ب PBS في درجة حرارة الغرفة لتجنب تكوين الفقاعات. طول الأنبوب ليس حرجا.
   6. دع الأنبوب يبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 دقيقة.
   7. املأ أنبوب الرنين المغناطيسي النووي لوحدة التدفق مسبقا ب 100 ميكرولتر من PBS في درجة حرارة الغرفة.
   8. يلقي خيوط الخلايا المضمنة في الاغاروز في أنبوب الرنين المغناطيسي النووي لوحدة التدفق عن طريق دفع المحقنة برفق. < / > ملاحظه: لملء أنبوب الرنين المغناطيسي النووي بشكل متجانس ، ابدأ بوضع نهاية أنبوب نظرة خاطفة في الجزء السفلي من أنبوب الرنين المغناطيسي النووي واستمر نحو الأعلى بينما يتأرجح ببطء من اليسار إلى اليمين.
   9. كرر الخطوات 3.2.5 و 3.2.6 و 3.2.8 حتى يتم صب كل تعليق الخلية الاغاروز.
3. أدخل الخلايا في المفاعل الحيوي.
   1. قم بإزالة أنبوب الرنين المغناطيسي النووي الفارغ من وحدة التدفق وقم بزيادة معدل التدفق إلى 2 مل / دقيقة لبضع دقائق لإزالة فقاعات الغاز المتبقية في أنبوب المدخل.
   2. اضبط معدل التدفق على 0.2 مل / دقيقة وأدخل أنبوب الرنين المغناطيسي النووي الذي يحتوي على الخلايا عن طريق دفعه لأعلى ببطء ولكن بثبات. < / > ملاحظه: يتجنب التدفق النشط للوسيط التدفق العكسي لمحتوى الأنبوب عبر المدخل الذي قد يحدث أثناء الإدخال.

< ص الفئة = "jove_title" >4. تشغيل المفاعل الحيوي وتنظيفه

1. عملية المفاعل الحيوي أثناء تجربة الرنين المغناطيسي النووي.
   1. اضبط درجة الحرارة في مطياف الرنين المغناطيسي النووي على 310 كلفن.
   2. أدخل وحدة التدفق في مقياس الطيف.
   3. قم بتزويد وسط المفاعل الحيوي بمعدل تدفق 0.1 مل / دقيقة طوال مدة تجارب الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية.
   4. في الوقت المطلوب أثناء التجربة ، قم بحقن محلول مركز من الجزيء الخارجي في زجاجة الخزان المتوسطة عن طريق ثقب أنبوب السيليكون بحقنة معقمة طويلة الإبرة. < / > ملاحظه: يجب اختيار التركيز النهائي للجزيء في الوسط بناء على المعرفة السابقة بسمية الخلية ، وإذا كان متاحا ، على معدل الانتشار المتوقع / المقدر عبر غشاء الخلية.
   5. في نهاية تجربة الرنين المغناطيسي النووي ، استبدل الأنبوب الذي يحتوي على الخلايا بأنبوب فارغ واشطف وحدة التدفق بالماء.
2. المفاعل الحيوي نظيف في المكان.
   1. قم بتنظيف وحدة التدفق عن طريق تدفق المحاليل التالية بمعدل 1 مل / دقيقة: 0.2 م هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) ؛ 3 M حامض الستريك ؛ 0.2 M هيدروكسيد الصوديوم ، لمدة 30 دقيقة على الأقل لكل منها ، متبوعا بماء فائق النقاء مفلتر معقم لمدة >2 ساعة.
   2. قم بتنظيف وتعقيم زجاجة الخزان ومجموعة الأنابيب بعد كل تشغيل.

< p class = "jove_title" >5. تجارب الرنين المغناطيسي

النووي

1. إعداد تجارب الرنين المغناطيسي النووي.
   ملاحظه: قم بتنفيذ هذه الخطوات مسبقا ، قبل تحضير عينة الرنين المغناطيسي النووي داخل الخلية ، لتجنب أي تأخير بين جمع الخلايا والحصول على البيانات.
   1. قم بإنشاء مجموعة بيانات جديدة في مطياف الرنين المغناطيسي النووي وقم بتعيين المعلمات لتجارب الرنين المغناطيسي النووي المطلوبة.
   2. تعيين المعلمات لتجارب الرنين المغناطيسي النووي 1D ^1H.
   3. قم بتوسيط تردد الموجة الحاملة ¹H عند 4.7 صفحة في الدقيقة على إشارة الماء.
   4. حدد برنامج النبض zgesgp ، واضبط العرض الطيفي على 20 جزء في المليون ، ونبضة 1,000 ميكرو ثانية 180 درجة مربعة لقمع الماء. قم بتعيين تأخير بين المسح الضوئي بمقدار 1 ثانية. احصل على الطيف من خلال 32 عملية فحص.
   5. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن CA II غير المسمى: حدد برنامج النبض p3919gp ، واضبط العرض الطيفي على 30 صفحة في الدقيقة لتغطية منطقة imino من الطيف ، واضبط التأخير لقمع الماء ذي الحدين بحيث يتم تركيز الإثارة القصوى عند التحولات الكيميائية للإشارات ذات الأهمية (d7 = 20 μs عند 950 ميجاهرتز). قم بتعيين تأخير بين المسح الضوئي يبلغ ≥1 ثانية. احصل على 512 عملية فحص.
   6. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن ¹⁵N-N SOD1: حدد برنامج النبض sfhmqf3gpph ، واضبط العرض الطيفي ¹H و ¹⁵N على 16 و 50 جزء في المليون ، على التوالي ، وإزاحة النبضة على شكل وعرض نطاق الإثارة إلى 8.5 و 6 جزء في المليون ، على التوالي ، ونبضة 350 ميكرو ثانية لمخطط الفصل (garp4 أو غيره حسب الأداة). قم بتعيين تأخير المسح الداخلي بمقدار 0.3 ثانية. احصل على 16 عملية مسح ضوئي و128 زيادة في البعد ¹⁵نيوتن.
2. اكتساب أطياف الرنين المغناطيسي النووي في الوقت الفعلي.
   1. بمجرد إدخال المفاعل الحيوي في مطياف الرنين المغناطيسي النووي ، انتظر بضع دقائق للسماح بتبادل الوسط. < / > ملاحظه: تتم مراقبة هذه العملية بسهولة من ظهور إشارة القفل حيث يتم استبدال PBS بوسيط يحتوي على 2٪ D₂O.
   2. اضبط مطابقة وضبط قناة ¹H ، وقم بتقطيع المغناطيس ، واحسب طول النبضة الصلبة ¹H 90 درجة.
   3. اضبط مستويات طاقة ¹H في كل تسلسل نبضة وفقا للنبضة الصلبة ¹H.
   4. سجل طيف zgesgp ¹H الأول للتحقق من محتوى العينة وتجانس المجال.
   5. انسخ تجارب zgesgp و p3919gp/sfhmqcf3gpph إلى الرقم المطلوب ووضعها في قائمة الانتظار في التخزين المؤقت للاكتساب.
      ج: تستخدم أطياف zgesgp فقط للتحكم في حالة العينة وتجانس المجال. لذلك ، يمكن تخطيها أو تسجيلها بشكل أقل تكرارا.
   6. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن CA II غير المسمى: قم بمعالجة أطياف p3919gp عن طريق تطبيق وظيفة نافذة توسيع الخط الصفري والأسي (LB = 20 هرتز).
   7. بالنسبة للخلايا التي تعبر عن ¹⁵N-N SOD1: قم بمعالجة أطياف sfhmqcf3gpph عن طريق تطبيق وظيفة نافذة الجرس الجيبية المربعة (SSB = 2) في كلا البعدين.
      ملاحظه: يمكن تقليل حجم الأطياف المعالجة بشكل أكبر عن طريق إزالة المناطق الخالية من الإشارات (في Topspin ، يتم ذلك عن طريق تعيين قيم STSR و STSI المطلوبة).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات المواد حامض الستريك سيجما ألدريتش 251275 D2O سيجما ألدريتش 453366 DMEM، ارتفاع نسبة الجلوكوز تقنيات الحياة 10313-021 DMEM ، ارتفاع الجلوكوز ، مسحوق سيجما ألدريتش د5648 FBS تقنيات الحياة 10270 حمض الهيدروكلوريك سيجما ألدريتش 30721 L-جلوتامين (200 ملم) تقنيات الحياة هاتف 25030 الاغاروز منخفض التبلور ، مسحوق سيجما ألدريتش أ 4018 NaHCO3 ، مسحوق كارلو إربا 478537 برنامج تلفزيوني تقنيات الحياة 10010 البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) تقنيات الحياة 15140-122 كريات هيدروكسيد الصوديوم سيجما ألدريتش 30620 التربسين EDTA (0.05٪ (بالوزن / الحجم الحجم)) تقنيات الحياة هاتف: 25300-054 معدات مطياف Avance III مزود بمسبار التبريد مقاس 5 مم بروكر غير متاح جميع مقاييس الطيف الحديثة والمغناطيس ضيق التجويف المجهزة بمجسات 5 مم متوافقة. وحدة تدفق InsightMR بروكر غير متاح وحدة المضخة P-920 من ÄKTA FPLC جنرال إلكتريك للرعاية الصحية غير متاح يجب أن تكون أي مضخة FPLC أو HPLC التمعجية أو الحقنة متوافقة مع وحدة التدفق.