$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
ملاحظة: فيما يلي خطوات فحص العاثيات T7 التي تتعرف على الأدوية باستخدام مستشعر حيوي QCM واستعادة العاثيات التي تم فحصها عبر بكتريا قولونية (BLT5615) العدوى. يمكن العثور على بروتوكولات تخليق مشتق من جزيء صغير يشكل طبقة أحادية التجميع ذاتيا (SAM) ولبناء مكتبة الببتيد العشوائية T7 المعروضة على العاثية 15 مير في مكان آخر.
فئة
1. تحضير شريحة مستشعر QCM
- قم بتوصيل شريحة مستشعر خزفية على مذبذب جهاز QCM بسرعة 27 ميجاهرتز ، وسجل التردد الجوهري (Hz) في طور الهواء قبل تثبيت الجزيئات الصغيرة.
- افصل الرقاقة وأسقط 20 ميكرولتر من محلول (1 ملي مولار في 70٪ إيثانول) من مشتق جزيء صغير يشكل SAM على القطب الذهبي لشريحة المستشعر باستخدام ماصة.
أنذر: بلورة رقاقة المستشعر حيث يوجد القطب الذهبي (Au ، سمك 0.1 مم ، معرف 2.5 مم ، 4.9 مم2) رقيقة للغاية وقد تتشقق بسهولة (SiO2 ، سمك 0.06 مم ، معرف 9 مم). ومن ثم ، ماصة بعناية.
- اتركيه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة (حوالي 20 درجة مئوية) في طبق بتري مع منديل مبلل ومحمي من أضواء الغرفة.
- اغسل سطح القطب برفق بالماء عالي النقاء ؛ ثم قم بإزالة قطرات الماء عن طريق نفخ الهواء بحقنة أو منفضة هواء.
- قم بإعداد شريحة المستشعر لجهاز QCM وسجل الانخفاض في التردد في طور الهواء لقياس كمية الجزيء الصغير الذي تم تجميده.
ملاحظه: على الأقل ، 100 هرتز من التردد الجوهري ضروري لتثبيت الجزيئات الصغيرة بنجاح (1 هرتز يشل حركة 30 بيكوغرام).
< p class = "jove_title" >
2. التقسيم الحيوي لمكتبة العاثيات T7 باستخدام مستشعر حيوي QCM (
الشكل 1)
- ضع كوفيت مع محرك مغناطيسي مخصص على المستشعر الحيوي QCM واسكب 8 مل من المخزن المؤقت للتفاعل (10 ملي Tris-HCl ، 200 ملي كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7-8) في الكوفيت.
- قم بتوصيل شريحة مستشعر QCM بالمذبذب واسحب ذراع المذبذب لأسفل لغمر الشريحة في المخزن المؤقت الذي يتم تحريكه عند 1000 دورة في الدقيقة.
- ابدأ في مراقبة تردد QCM على الكمبيوتر الشخصي (PC) وانتظر حتى يوازن جهاز الاستشعار إلى حوالي 3 هرتز / دقيقة من انحراف التردد.
- حقن 8 ميكرولتر من مكتبة العاثيات T7 (1-2 × 1010 pfu/mL) في الكوفيت (التركيز النهائي: 1-2 × 107 pfu/mL) وقم بتمييز نقطة الحقن على المستشعر.
- راقب تقليل التردد الناجم عن ارتباط العاثيات T7 بالجزيء الصغير الثابت على سطح القطب الذهبي لمدة 10 دقائق.
- أوقف جهاز مراقبة تردد QCM ، وقم بإزاحة شريحة المستشعر من المذبذب ، وقم بإزالة المخزن المؤقت عن طريق نفخ الهواء و / أو الفتل بالمناديل.
- ضع شريحة المستشعر في طبق بتري رطب وقم بإسقاط 20 ميكرولتر من تعليق الإشريكية القولونية (BLT5615) (OD600 = 0.5-1.0 بعد الاهتزاز عند 37 درجة مئوية عن طريق إضافة IPTG إلى 1 ملليمتر) الخلايا المضيفة في مرحلة السجل على القطب الذهبي.
- أغلق غطاء الطبق وقم بتغطيته بورق الألمنيوم لحجب الضوء.
- احتضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة على خلاط صفيحة دقيقة 96 بئرا (1000-1500 دورة في الدقيقة) لتعزيز استعادة العاثيات T7 المقلدة.
- استرجع 20 ميكرولتر من المحلول وعلقه في 200 ميكرولتر من رطل متوسط.
ملاحظه: يمكن حفظ العينات التي تم الحصول عليها في هذه الخطوة عند 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد.
- قم بإعداد سلسلة تخفيف من محلول العاثيات لعزل البلاك وتسلسل الحمض النووي وفقا للإجراء العام الموضح في تعليمات الشركة المصنعة.
