كروماتوغرافيا استبعاد الحجم مع تشتت الضوء متعدد الزوايا لقلة البروتين

الملخص

المصدر: Some ، D. et al. ، توصيف البروتينات عن طريق كروماتوغرافيا استبعاد الحجم المقترنة بتشتت الضوء متعدد الزوايا (SEC-MALS). J. VIS. EXP. (2019).

يصف هذا الفيديو SEC-MALS، الذي يستفيد من قدرات كروماتوغرافيا استبعاد الحجم (SEC) وتشتت الضوء متعدد الزوايا (MALS). في SEC-MALS ، تفصل SEC البروتينات أو مجمعات البروتين بناء على حجمها ، ويحدد كاشف MALS متوسط الوزن الجزيئي عن طريق قياس شدة الضوء المتناثر بواسطة الجزيء بزوايا مختلفة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. إعداد النظام

1. قم بتوصيل كاشفات MALS و dRI في اتجاه مجرى كاشف الأشعة فوق البنفسجية الخاص ب FPLC. تجاوز كاشفات الأس الهيدروجيني والتوصيلية الكهربية لأنها ستضيف حجما كبيرا بين الكاشفات بين الكاشفات فوق البنفسجية وكاشفات MALS. استخدم أنابيب شعرية بحجم 0.25 مم من العمود إلى أجهزة الكشف وبينها ، و 0.75 مم هوية الأنابيب الشعرية على إخراج أجهزة الكشف عن النفايات أو مجمع الكسور.
2. تأكد من إنشاء توصيلات الإشارة اللازمة بين FPLC وأجهزة الكشف ، بما في ذلك الإخراج التناظري من كاشف الأشعة فوق البنفسجية إلى الإدخال التناظري MALS ، والإخراج الرقمي من FPLC إلى الحقن التلقائي ل MALS ، عبر صندوق الإدخال / الإخراج الخاص ب FPLC.
3. قم بتثبيت عمود SEC تحليلي مناسب يغطي نطاق تجزئة لا يقل عن 20 كيلو دالتون إلى 500 كيلو دالتون. تحقق من معلومات المنتج لتحديد ما إذا كان العمود مناسبا لنطاق ميغاواط ودرجة الحموضة والخصائص الأخرى للعينة والمرحلة المتنقلة.

< p class = "jove_title" >2. تحضير المخزن المؤقت ، وتنظيف النظام طوال الليل ، والتحقق من النظافة

1. باستخدام كواشف من الدرجة HPLC ، قم بإعداد 1 لتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات مع 50-100 ملي كلوريد الصوديوم. قم بتصفية المخزن المؤقت إلى 0.1 ميكرومتر باستخدام مرشح بولي إيثر سلفون أعلى الزجاجة أو ما شابه ذلك. قم بتصفية أول 50-100 مل من المخزن المؤقت في زجاجة النفايات وتخلص منها ، من أجل التخلص من الجسيمات من المرشحات الجافة ، ثم قم بتصفية الباقي إلى زجاجة نظيفة ومعقمة تم غسلها جيدا بالماء المصفى منزوع الأيونات ومغطاة لمنع دخول الغبار.
   ملاحظه: يمكن استخدام مذيبات الطور المتنقل الأخرى مثل المخزن المؤقت Tris إذا تم تحليل البروتينات الإضافية التي يتم إذابتها بشكل تفضيلي في تلك المذيبات.
2. اغسل طوال الليل بمعدل تدفق 0.5 مل / دقيقة ، أو على النحو الموصى به من قبل الشركة المصنعة للعمود ، لموازنة العمود في المخزن المؤقت وإزالة الجسيمات. استخدم وضع التدفق المستمر الخاص ب FPLC وتأكد من عدم توقف التدفق حتى تكتمل جميع عمليات تشغيل SEC-MALS.
   1. ضع خلية تدفق dRI في وضع التطهير أثناء التدفق طوال الليل. قم بإيقاف تشغيل الإزالة قبل بدء تشغيل العينة.
   2. عند بدء التدفق ، قم بتكثيف معدل التدفق تدريجيا لمنع تأثير "تساقط العمود" (أو إطلاق الجسيمات) الناجم عن التغير المفاجئ في الضغط في العمود.
   3. إذا كان من المعروف أن النظام مستقر تماما وخالي من الجسيمات ، وفي حالة توازن مع المرحلة المتنقلة المرغوبة ، فاستبدل التدفق الليلي بتدفق أقصر ، 2-3 ساعات.
3. تحقق من نظافة النظام عن طريق النقر برفق على الأنبوب في اتجاه مجرى العمود لإطلاق الجسيمات المتراكمة ومراقبة الإشارة في كاشف 90 درجة على شاشة اللوحة الأمامية لأداة MALS. تحقق من أن الضوضاء من الذروة إلى الذروة لا تزيد عن 50-100 ميكرو فولت.
4. قم بإجراء حقنة "فارغة" للتحقق من أن الحاقن نظيف من الجسيمات. "الفراغ" هو ببساطة المخزن المؤقت الجاري ، المحضر في قارورة جديدة ومعقمة.
   1. إذا كانت ذروة الجسيمات لا تزيد عن 1 مل في الحجم ولا تزيد عن 5 مللي فولت فوق خط الأساس ، فهذا يعني أن النظام جاهز للعينات. خلاف ذلك ، قم بإجراء حقن فارغة إضافية حتى يتم تنظيفها ، أو إجراء الصيانة لتنظيف الحاقن.

< p class = "jove_title" >3. تحضير العينة وتحميلها

1. قم بإعداد ما لا يقل عن 200 ميكرولتر من BSA عند 1-2 مجم / مل في المخزن المؤقت SEC.
   ملاحظه: من أجل منع هطول الأمطار ، لا ينبغي أبدا إذابة BSA في الماء النقي.
2. قم بتصفية البروتين إلى 0.02 ميكرومتر باستخدام مرشح طرف المحقنة.
3. تخلص من القطرات القليلة الأولى من المرشح للتخلص من الجسيمات من المرشحات الجافة.
4. بدلا من ذلك ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 10,000 × جم لمدة 15 دقيقة لتمكين ترسيب الركام غير القابل للذوبان والجسيمات الكبيرة الأخرى.
5. حقن 100 ميكرولتر من محلول BSA في الحلقة.
   ملاحظه: هذه هي الكمية الموصى بها من المواد ، ويمكن حقنها أكثر أو أقل وفقا لظروف العينة مثل الاستقرار أو التوافر. تختلف كمية البروتين المطلوبة لكل حقنة عكسيا مع الوزن الجزيئي ضعف كتلة البروتين المطلوبة إذا كان الوزن الجزيئي 33 كيلو دالتون أو نصف وزن BSA.

4. إعداد برنامج MALS

1. فتح جديد | جرب من الطريقة في قائمة برامج MALS وحدد الطريقة عبر الإنترنت من مجلد أساليب نظام تشتت الضوء. في حالة وجود كاشف DLS، حدد الطريقة عبر الإنترنت من تشتت الضوء | مع مجلد QELS.
2. في قسم التكوين، قم بتعيين معلمات العينة والمرحلة المحمولة.
   1. في طريقة عرض المضخة العامة، قم بتعيين معدل التدفق إلى معدل التدفق المستخدم في FPLC.
   2. في طريقة عرض المضخة العامة، فرع المذيب، الاسم، حدد PBS.
   3. في عرض الحاقن ، فرع العينة ، أدخل الاسم ك BSA ، واضبط dn / dc = 0.185 (القيمة القياسية للبروتينات غير المعدلة) ، A2 = 0 ، ومعامل انقراض الأشعة فوق البنفسجية = 0.667 مل / (ملغ-سم).
      ملاحظه: بالنسبة للبروتينات الأخرى ، يمكن العثور على معامل الانقراض للأشعة فوق البنفسجية₂₈₀ نانومتر في الأدبيات أو حسابه من تسلسله باستخدام العديد من أدوات برامج المجال العام.
3. في قسم الإجراءات، طريقة عرض المجموعة الأساسية، حدد خانة الاختيار المشغل عند الحقن التلقائي وقم بتعيين مدة التشغيل إلى 70 دقيقة بحيث يتم جمع البيانات للشطف بالكامل حتى يتم الوصول إلى إجمالي حجم النفاذية لعمود SEC.
   ملاحظه: قد يختلف مقدار الوقت اللازم باختلاف العمود ومعدل التدفق - 35 دقيقة من التجميع مطلوبة لعمود HPLC-SEC قياسي مقاس 7.8 مم × 300 مم عند 0.5 مل / دقيقة.
4. ابدأ التجربة في برنامج MALS بالنقر فوق الزر تشغيل. سيبدأ في قراءة البيانات بعد تلقي إشارة النبض من أداة FPLC عبر كاشف MALS.
5. قم بتصفير إشارة dRI بالنقر فوق الزر Autozero على اللوحة الأمامية للأداة.

< p class = "jove_title" >5. إعداد برنامج FPLC

1. أدخل اسم البروتين وتشغيله في برنامج FPLC ، في يدوي | تنفيذ التعليمات اليدوية | ضع علامة.
2. قم بتبديل صمام الحقن من الحمل اليدوي إلى الحقن تحت مسار التدفق | صمام الحقن.
3. قم بتضمين إشارة نبضية عن طريق إدخال نبضة 0.5 ثانية أسفل صندوق الإدخال / الإخراج | نبض رقمي. سيؤدي ذلك إلى جمع البيانات في برنامج MALS.

6. حقن العينة في الحلقة. انقر فوق تنفيذ في برنامج FPLC لبدء تشغيل التجربة.

المواد