تنقية تقارب التكميل ثنائي الجزيئات لعزل بروتينين متفاعلين

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: هاستينغز ، جي إف وآخرون تشريح مجمعات الإشارات متعددة البروتينات عن طريق تنقية تقارب التكميل ثنائي الجزيئات (BiCAP). J. Vis. إكسب. (2018)

في هذا الفيديو ، أظهرنا تنقية تقارب التكميل ثنائي الجزيئات ، BiCAP ، لاكتشاف وعزل ثنائيات بروتين معينة باستخدام الأجسام المضادة أحادية المجال الخاصة بالتشكل.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. زراعة الخلايا والتعداء

ملاحظة: من أجل تعداء متجهات BiFC ، من المهم تحقيق كفاءة عالية وتعداء متجانسة نسبيا. من المحتمل أن تكون المتجهات متوافقة مع أي كاشف تعدي قياسي ، ويجب تحسين ظروف التعدي وفقا لذلك. لإجراء قياس الطيف الكتلي ، عادة ما نزرع الخلايا في أطباق 10 سم ، على الرغم من أنه يمكن أيضا تقليص هذا بشكل متناسب إلى أطباق أو أطباق أصغر للتجارب التي تتطلب مواد أقل.

1. البذور 1.0 × 10⁶ خلايا HEK293T في طبق 10 سم مع 10 مل من وسائط DMEM ، مكملة بنسبة 10٪ FBS و Penicillin / Streptomycin (1: 100).
قم
2. بتخفيف 2.5 ميكروغرام من كل ناقل BiFC إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتعداء (انظر جدول المواد) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
3. أضف 10 ميكرولتر من كاشف النفقة (انظر جدول المواد).
4. خليط دوامة لمدة 10 ثوان ، ثم جهاز طرد مركزي لفترة وجيزة. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
5. أضف خليط تعداء الحمض النووي إلى الطبق بالتنقيط. احتضان الخلايا لفترة كافية من الوقت حتى تتفاعل بروتينات اندماج BiFC ولطي كوكب الزهرة ونضوج الفلوروفور ، بشكل عام ~ 8 - 24 ساعة
   ملاحظة: تبلغ ذروة الإثارة لكوكب الزهرة 515 نانومتر ، وتبلغ ذروة انبعاثها 528 نانومتر ، على الرغم من أنه يمكن عرض ذلك بسهولة باستخدام مجهر فلوري قياسي تم إعداده لتصور مضان GFP.

< p class = "jove_title" >2. إعداد العينة

1. حصاد المحلل
   1. قبل جمع المحللة ، قم بإعداد Cell Lysis Buffer [50 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.4) ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 1 ملي مولار EDTA ، 1٪ (حجم / حجم) منظف غير أيوني (انظر جدول المواد)]. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
   2. قبل الحصاد مباشرة ، استكمل 10 مل من Cell Lysis Buffer مع مثبط الإنزيم البروتيني ومثبط الفوسفاتيز (انظر جدول المواد). احتفظ بمحلول تحلل الخلايا المكمل على الجليد.
   3. اغسل الخلايا مرتين في PBS المثلج. استنشق PBS وأضف 1 مل من Cell Lysis Buffer المكمل بالثلج. ضع الطبق على الثلج ، مع التأكد من انتشار المخزن المؤقت على مساحة السطح بأكملها.
   4. احتضن على الجليد لمدة 5 دقائق تقريبا ، ثم استخدم مكشطة خلية (انظر جدول المواد) لكشط الخلايا ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق مبرد مسبقا سعة 1.5 مل.
   5. قم بإزالة الحطام الخلوي عن طريق الطرد المركزي للمحللات المجمعة عند 18,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية ونقل المادة الطافية التي تم تطهيرها إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة جديدة.
      ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن استخدام المحللة على الفور ، أو تخزينها عند -80 درجة مئوية. يوصى أيضا بالاحتفاظ بكمية من المحللة الخام بحيث يمكن التحقق من صحة كفاءة التعداء وتنقية التقارب.
2. تنقية التقارب
   ملاحظه: يتم تنفيذ خطوة عزل BiCAP باستخدام الجسم النانوي GFP المترافق مع حبات الاغاروز (انظر جدول المواد).
   1. تحضير حبات الاغاروز عن طريق غسل حجم مناسب (20 ميكرولتر لكل عينة + 10 ميكرولتر زائد) في 1 مل PBS. الطرد المركزي للحبات عند 300 × جم وإزالة المادة الطافية.
   2. أضف 20 ميكرولتر إلى كل عينة محللة.
   3. احتضان العينات لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية مع دوران من طرف إلى طرف.
      ملاحظه: في هذه المرحلة ، يمكن تحضير العينات إما ل SDS-PAGE والنشاف الغربي ، أو التحليل عن طريق قياس الطيف الكتلي.
3. تحضير مادة BiCAP للنشاف الغربي.
   قم
   1. بالطرد المركزي للحبات عند 300 × جم واغسلها ثلاث مرات في عازلة تحلل الخلية.
   2. أعد تعليق الخرزات المغسولة في 50 ميكرولتر من عازلة العينة المخففة بشكل مناسب (انظر جدول المواد) وقم بتسخين العينات عند 95 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق < / > ملاحظه: يمكن تخزين العينات المحضرة بهذه الطريقة عند -20 درجة مئوية لعدة أشهر.
   3. قم بإجراء SDS-PAGE والنشاف الغربي لكل من علامة V1 وعلامات V2 (انظر جدول المواد) ، بالإضافة إلى أي بروتينات أخرى ذات أهمية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات DMEM جيبكو 11995-073 زراعة الخلايا FBS لايف تكنولوجيز أستراليا 10099-141 زراعة الخلايا البنسلين / الستربتومايسين لايف تكنولوجيز أستراليا 15070-063 زراعة الخلايا عازلة التعداء jetPRIME بولي بلس 114-15 زراعة الخلايا كاشف التعداء jetPRIME بولي بلس 114-15 زراعة الخلايا PhosSTOP (مثبط الفوسفاتيز) سيجما ألدريتش 4906837001 زراعة الخلايا كوكتيل كامل وخالي من مثبطات البروتياز الخالي من EDTA روش 11873580001 أدوات بلاستيكية مكشطة الخلية سارستيدت 83.1832 GFP-Trap_A كروموتيك جي إم بي إتش جي تي اي-100 جسم نانوي GFP مقترن بخرز الاغاروز الجسم المضاد أحادي النسيلة GFP الطرفي N كوفانس MMS-118P سوف يكتشف علامة V1 داخل متجهات BiFC الجسم المضاد أحادي النسيلة GFP الطرفي C روش 11814460001 سيكتشف علامة V2 داخل متجهات BiFC عينة المخزن المؤقت إنفيتروجين NP0008 يستكمل ب 1 مل β-mercaptoethanol. التربسين المعدل من الدرجة المتسلسلة شركة بروميجا الطراز V5117h زراعة الخلايا أنابيب الطرد المركزي الدقيقة LoBind تشخيص نقاط الرعاية 0030 108 116 أدوات بلاستيكية يودوأسيتاميد سيجما ألدريتش I1149-5G محضر بكمية 5 ملغم/مل في ماء فائق النقاء LTQ أوربيتراب فيلوس برو ثيرمو فيشر خلايا DH5α ثيرمو فيشر خلايا مختصة بالصدمات الحرارية