Method Article

تنقية تقارب التكميل ثنائي الجزيئات لعزل بروتينين متفاعلين

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: هاستينغز ، جي إف وآخرون تشريح مجمعات الإشارات متعددة البروتينات عن طريق تنقية تقارب التكميل ثنائي الجزيئات (BiCAP). J. Vis. إكسب. (2018)

في هذا الفيديو ، أظهرنا تنقية تقارب التكميل ثنائي الجزيئات ، BiCAP ، لاكتشاف وعزل ثنائيات بروتين معينة باستخدام الأجسام المضادة أحادية المجال الخاصة بالتشكل.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >1. زراعة الخلايا والتعداء

ملاحظة: من أجل تعداء متجهات BiFC ، من المهم تحقيق كفاءة عالية وتعداء متجانسة نسبيا. من المحتمل أن تكون المتجهات متوافقة مع أي كاشف تعدي قياسي ، ويجب تحسين ظروف التعدي وفقا لذلك. لإجراء قياس الطيف الكتلي ، عادة ما نزرع الخلايا في أطباق 10 سم ، على الرغم من أنه يمكن أيضا تقليص هذا بشكل متناسب إلى أطباق أو أطباق أصغر للتجارب التي تتطلب مواد أقل.

  1. البذور 1.0 × 106 خلايا HEK293T في طبق 10 سم مع 10 مل من وسائط DMEM ، مكملة بنسبة 10٪ FBS و Penicillin / Streptomycin (1: 100).
    2. قم
  2. بتخفيف 2.5 ميكروغرام من كل ناقل BiFC إلى 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت لل....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments DMEM جيبكو 11995-073 زراعة الخلايا FBS لايف تكنولوجيز أستراليا 10099-141 زراعة الخلايا البنسلين / الستربتومايسين لايف تكنولوجيز أستراليا 15070-063 زراعة الخلايا عازلة التعداء jetPRIME بولي بلس 114-15 زراعة الخلايا كاشف التعداء jetPRIME بولي بلس 114-15 زراعة الخلايا PhosSTOP (مثبط الفوسفاتيز) سيجما ألدريتش 4906837001 زراعة الخلايا كوكتيل كامل وخالي من مثبطات البروتياز الخالي من EDTA روش 11873580001 أدوات بلاستيكية مكشطة الخلية سارستيدت 83.1832 GFP-Trap_A كروموتيك جي إم بي إتش جي تي اي-100 جسم نانوي GFP مقترن بخرز الاغاروز الجسم المضاد أحادي النسيلة GFP الطرفي N كوفانس MMS-118P سوف يكتشف علامة V1 داخل متجهات BiFC الجسم المضاد أحادي النسيلة GFP الطرفي C روش 11814460001 سيكتشف علامة V2 داخل متجهات BiFC عينة المخزن المؤقت إنفيتروجين NP0008 يستكمل ب 1 مل β-mercaptoethanol. التربسين المعدل من الدرجة المتسلسلة شركة بروميجا الطراز V5117h زراعة الخلايا أنابيب الطرد المركزي الدقيقة LoBind تشخيص نقاط الرعاية 0030 108 116 أدوات بلاستيكية يودوأسيتاميد سيجما ألدريتش I1149-5G محضر بكمية 5 ملغم/مل في ماء فائق النقاء LTQ أوربيتراب فيلوس برو ثيرمو فيشر خلايا DH5α ثيرمو فيشر خلايا مختصة بالصدمات الحرارية

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Bimolecular ComplementationAffinity PurificationProtein Interaction DetectionFluorescence MicroscopyAgarose BeadsWestern BlottingSDS PAGECell LysisTransfection ReagentHEK293T Cells

Related Articles