كالوريمتر المسح التفاضلي لدراسة تفاعل الترابط الحراري للحمض النووي

الملخص

المصدر: Mittermaier, A. K., et al. قياس ملامح DSC الجزيئية الحيوية باستخدام روابط حرارية لتوصيف تفاعلات الطي والربط بسرعة. J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو كالوريمتر المسح التفاضلي - وهي تقنية لدراسة التفاعل بين الجزيء الحيوي والترابط. تتم دراسة ارتباط أبتامر الحمض النووي والترابط الحراري من خلال تطبيق دورات تسخين وتبريد متكررة على العينة والحصول على عمليات مسح للتحليل الديناميكي الحراري.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير العينة

1. تنقية الجزيء الحيوي المطلوب.
   ملاحظه: يستخدم هذا البروتوكول أبتامر الحمض النووي المرتبط بالكوكايين MN4 الذي تم شراؤه بعد التبادل مقابل 2 M كلوريد الصوديوم ثلاث مرات متبوعا بثلاث جولات من الماء منزوع الأيونات باستخدام مرشح طرد مركزي بغشاء قطع بوزن جزيئي 3 كيلو دالتون.
2. قم بتصنيع وتنقية أو شراء الترابط الحراري المطلوب.
   ملاحظه: MN4 يربط الكوكايين الليجند الحراري. MN4 يربط أيضا الكينين ، والذي يستخدم كعنصر تحكم سلبي لقابلية الترابط الحرارية في درجات الحرارة التجريبية هذه.
3. قم بإعداد مخازن مؤقتة لغسيل الكلى للجزيء الحيوي المنقى وإذابة الروابط (20 ملي مولار فوسفات الصوديوم و 140 ملي مولار كلوريد الصوديوم ، درجة الحموضة 7.4 ، ل MN4 والروابط المستخدمة هنا).
4. غسيل الكلات للجزيء الحيوي مقابل 2 لتر على الأقل من المخزن المؤقت باستخدام أنبوب غسيل الكلى بقطع 0.5 - 1.0 كيلو دالتون.
5. قم بتصفية المخزن المؤقت النهائي (المشار إليه باسم المخزن المؤقت للعمل) من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر تم موازنته تماما مع المخزن المؤقت.
6. قم بوزن الكتل المرغوبة من الروابط وحلها في مخزن مؤقت يعمل مفلتر. إذا كانت تركيزات الترابط المرغوبة تتطلب كتل صغيرة جدا بحيث لا يمكن وزنها بدقة ، فقم بعمل محلول مخزون ترابط مركز (10x على سبيل المثال).
   ملاحظه: من الأهمية بمكان أن تستخدم جميع تجارب DSC نفس المخزن المؤقت للعمل للعينة والترابط ، أي عدم إجراء تجربة حيث يتم إذابة الترابط في دفعة مختلفة من المخزن المؤقت العامل عن الجزيء الحيوي لأن هذا سيؤدي إلى عدم تطابق المخزن المؤقت في البيانات.
7. قم بتصفية محلول مخزون الجزيئات الحيوية من خلال مرشح 0.2 ميكرومتر تم موازنته تماما مع المخزن المؤقت للعمل.
8. تحديد تركيز الجزيئات الحيوية عن طريق قياسات الامتصاص (260 نانومتر للأحماض النووية مثل MN4 و 280 نانومتر للبروتينات).
9. قم بتخزين الجزيء الحيوي والرابط المحضرين في ثلاجة 4 درجات مئوية (مناسبة ل MN4 والروابط المستخدمة هنا) ، أو عند -20 أو -80 درجة مئوية إذا كان الجزيء الحيوي والروابط يتحمل التجميد والتخزين طويل الأجل مطلوبا. قم بإزالة الغاز من المحاليل العازلة والجزيء الحيوي والترابط في مزيل الغازات على سطح الطاولة (انظر جدول المواد) قبل التحميل في DSC.
   ملاحظه: يساعد التفريغ على منع تكوين الفقاعات في DSC في درجات حرارة أعلى. تتسبب الفقاعات في عناصر الإشارة التي تحجب أشكال ذروة DSC وخطوط الأساس.

2. إعداد DSC

1. قم بفك مقبض الضغط من DSC (انظر جدول المواد).
2. قم بتشغيل أنابيب السيليكون من عازلة العمل وقم بتوصيلها بالحافة الأمامية (الفتحة المعدنية) للشعيرات الدموية المرجعية.
3. قم بإنشاء جسر بين الشعيرات الدموية المرجعية والعينة عن طريق توصيل الحافة المرجعية الخلفية بشفة العينة الأمامية.
4. قم بتوصيل قطعة من أنابيب السيليكون بشفة العينة الخلفية التي تمتد إلى قارورة نفايات مع خط تفريغ متصل.
5. قم بتشغيل خط التفريغ لتنظيف كالوريمتر التفاضلي التفاضلي الضوئي (DSC) بسعة 200 مل من المخزن المؤقت للعمل.
6. قم بتحميل الشعيرات الدموية المرجعية ل DSC بمخزن مؤقت للعمل. قم بتوصيل أقسام من 3 إلى 5 سم تقريبا من أنابيب السيليكون بالشفاه الشعرية المرجعية.
7. أدخل طرف ماصة سعة 1 مل في أنبوب السيليكون للحافة الخلفية. اسحب 0.8 مل من المخزن المؤقت للعمل باستخدام ماصة وأدخل طرف الماصة مع المخزن المؤقت في أنبوب السيليكون للحافة المرجعية الأمامية.
8. اضغط برفق على مكبس الماصة لأسفل لتمرير عازلة العمل عبر أنبوب السيليكون الأمامي إلى الشعيرات الدموية المرجعية وأعلى إلى طرف الماصة المرفق بالحافة الخلفية. اضغط على مكبس الماصة لأسفل حتى يصل مستوى عازلة العمل فوق أنبوب السيليكون الأمامي مباشرة، ثم حرر مكبس الماصة حتى يصل مستوى عازلة العمل فوق أنبوب السيليكون الخلفي مباشرة.
   1. كرر تمرير المخزن المؤقت للعمل ذهابا وإيابا لتطهير الحجم في الشعيرات الدموية المرجعية للفقاعات.
      ملاحظه: عادة ما تكون 10 تمريرات من المحلول ذهابا وإيابا كافية لمسح أي فقاعات.
قم
9. بتغطية طرف الماصة الخلفية بالإبهام واسحب طرف الماصة الخلفية والماصة الأمامية برفق لإزالتهما من الشفاه المرجعية مع توصيل أنبوب السيليكون.
10. قم بتحميل العينة الشعرية بمخزن مؤقت للعمل كما في الخطوات 2.6 - 2.9. ضع غطاء بلاستيكيا أسود على الحافة المرجعية الخلفية وعواف العينة ، مع ترك الشفاه الأمامية مكشوفة.
11. قم بتوصيل مقبض الضغط.
12. افتح برنامج DSC (انظر جدول المواد) واضغط على الجهاز بالنقر فوق السهم الأحمر لأعلى في الجزء العلوي من الواجهة بمجرد استقرار قراءة الطاقة ؛ يشار إلى طاقة DSC في مربع في أعلى يمين الواجهة جنبا إلى جنب مع درجة حرارة الجهاز وقراءة الضغط.
    ملاحظه: راقب قراءة الطاقة أثناء ضغط DSC. تشير التغييرات في قوة أكثر من ~ 10 ميكروواط إلى تكوين فقاعة في الشعيرات الدموية ، مما قد يتسبب في ظهور قطع أثرية في البيانات. يجب إزالة المحاليل وتفريغها بشكل أكبر قبل المتابعة.
13. قم بموازنة DSC مع المخزن المؤقت العامل عن طريق إجراء مسح أمامي وخلفي. في علامة التبويب "الطريقة التجريبية" على الجانب الأيسر من الشاشة ، تأكد من تحديد خيار "المسح" لتشغيل DSC في وضع مسح درجة الحرارة.
    ملاحظه: المعلمات التجريبية هي نطاق مسح درجة الحرارة ، ومعدل المسح ، ووقت التوازن في درجات الحرارة المنخفضة والعالية ، وعدد عمليات الفحص.
    1. في "معلمات درجة الحرارة" ضمن علامة التبويب "الطريقة التجريبية" ، انقر فوق الزر الخاص ب "التدفئة". أدخل 1 و 100 درجة مئوية لدرجات الحرارة التجريبية المنخفضة والعليا ، و 1 درجة مئوية / دقيقة لمعدل المسح ، و 60 ثانية لفترة التوازن.
    2. انقر فوق الزر "إضافة سلسلة" أسفل حقل الإدخال لفترة التوازن. أدخل 2 في حقل "خطوات الإضافة" في النافذة المنبثقة (لتسخين واحد ومسح تبريد واحد) وحدد مربع "التدفئة / التبريد البديل". انقر فوق "موافق" ؛ تظهر عمليات الفحص المضافة في الجزء السفلي من الواجهة. تأكد من أن معلمات كل فحص هي حسب الرغبة.
    3. ابدأ التجربة بالنقر فوق الزر الأخضر "تشغيل" في الجزء العلوي من الواجهة. انتقل إلى المجلد المطلوب وأدخل اسم ملف لحفظ التجربة في النافذة المنبثقة. اعرض تقدم التجربة بالنقر فوق علامة التبويب "البيانات" على يمين علامة التبويب "طريقة التجربة".

3. جمع مجموعات بيانات Ligand Thermolabile DSC

ملاحظة: يتكون الإجراء الأدنى من خمس تجارب: تجارب مرجعية عازلة مع وبدون ترابط (تستخدم للطرح الأساسي) ، وتجارب العينة مع الجزيء الحيوي الحر ، والجزيء الحيوي المرتبط بالترابط ، والجزيء الحيوي المرتبط بالترابط مع فترة توازن أطول في درجات الحرارة العالية.

1. قم بتشغيل التجارب المرجعية لطرح الخط الأساسي لبيانات العينة. أعد تحميل DSC بمخزن العمل في كلا الشعيرات الدموية وجمع العديد من عمليات المسح الأمامي والخلفي على نطاق درجة حرارة مناسب عند 1 درجة مئوية دقيقة -1 مع زمن توازن أعلى (درجة حرارة عالية) يبلغ 120 ثانية.
   1. احذف عمليات مسح توازن المخزن المؤقت السابقة من الجزء السفلي من الواجهة عن طريق تمييز كل منها على حدة والنقر فوق X الأحمر في منتصف يمين الواجهة. أضف عمليات المسح الجديدة بالنقر فوق الزر "إضافة سلسلة" ، وإدخال 20 في الحقل ل "خطوات الإضافة" ، وتحديد مربع "التدفئة / التبريد البديل". انقر فوق موافق وقم بتشغيل التجربة بالنقر فوق زر التشغيل الأخضر كما هو مذكور أعلاه.
   2. كرر الخطوات 3.1 - 3.1.1 مع مخزن مؤقت العمل الذي يحتوي على التركيز المطلوب من الترابط في كلا الشعيرات الدموية للحصول على التجارب المرجعية للترابط (اجمع تجربتين منفصلتين باستخدام 120 ثانية و 600 ثانية من أوقات التوازن في درجات الحرارة العالية على التوالي ، لاستخدامها في الحصول على ثابت المعدل لتحويل الترابط الحراري).
      ملاحظه: يضمن معدل المسح المستخدم هنا أن الجزيء الحيوي في التجارب اللاحقة في حالة توازن حراري في عمليات المسح الأمامي والعكسي. تؤدي معدلات المسح الضوئي < 0.1 - 0.2 درجة مئوية في الدقيقة -1 إلى مخططات حرارة صاخبة ولا تنطبق على تجارب DSC. يجب أن تمتد درجات الحرارة من أقل بكثير من درجة حرارة انصهار الجزيء الحيوي الحر إلى أعلى بكثير من درجة حرارة انصهار الجزيء الحيوي المشبع بالترابط (~ 20 - 80 درجة مئوية ل MN4). تحقق من قابلية تكرار عمليات الفحص (على سبيل المثال، تكفي 10 عمليات مسح أمامية و10 عمليات مسح عكسية لإجمالا 20).
   3. في حالة استخدام روابط متعددة (مثل الكوكايين والكينين) ، قم بغسل DSC ب 200 مل من المخزن المؤقت العامل (كرر من الخطوة 2.5) بين الجري لإزالة الروابط من الشعيرات الدموية ومنع التلوث المتبادل.
      ملاحظه: من المفيد إجراء تجربة مكررة على الجزيء الحيوي الحر بعد تشغيل مرتبط بالترابط من أجل التحقق مما إذا كان الترابط السابق يمتص بقوة الجدران الشعرية ولم تتم إزالته بشكل كاف باستخدام التنظيف العازل. إذا بدا أن مخططات الحرارة للجزيء الحيوي الحر قد تحولت إلى حجم أكبر ودرجة حرارة تمسخ أعلى بعد تجربة التمسخ المرتبطة بالترابط ، فمن المحتمل أن الترابط السابق لا يزال موجودا في المسعر بعد التنظيف. قم بإزالة الترابط الممتز عن طريق احتضان الشعيرات الدموية بنسبة 20٪ Contrad-70 لمدة ساعة واحدة عند 60 درجة مئوية مع إغلاق الأغطية البلاستيكية ومقبض الضغط. في برنامج DSC، قم بتغيير الوضع التجريبي إلى "متساوي الحرارة" ضمن علامة التبويب "الطريقة التجريبية". اختر 3,600 ثانية للمدة و 60 درجة مئوية لدرجة الحرارة متساوية الحرارة، مع إدخال صفر لزمن التوازن. انقر فوق "إضافة إلى الطريقة التجريبية". تظهر تجربة متساوية الحرارة في الجزء السفلي من الشاشة. بعد الانتهاء ، اغسل الجهاز ب 2 لتر من الماء منزوع الأيونات وكرر من الخطوة 2.5.
2. قم بتشغيل نماذج التجارب باستخدام نفس إجراء تحميل DSC والمعلمات التجريبية مثل عمليات المسح المرجعي. بالنسبة لمجموعة بيانات الجزيئات الحيوية الحرة ، تأكد من أن الشعيرات الدموية المرجعية تحتوي على المخزن المؤقت للعمل بينما تحتوي العينة الشعرية على الجزيء الحيوي الحر بالتركيز المطلوب في المخزن المؤقت للعمل.
   1. بالنسبة للتجارب المرتبطة بالترابط ، تأكد من أن الترابط موجود في المخزن المؤقت للعمل في الشعيرات الدموية المرجعية ، وأن الجزيء الحيوي بالإضافة إلى الترابط موجود في المخزن المؤقت للعمل في العينة الشعرية. اغسل النظام بين إضافات الروابط المختلفة كما في الخطوة 2.5.
3. قم بإجراء تجربة إضافية واحدة مع الجزيء الحيوي المرتبط بالترابط الحراري حيث تزداد فترة التوازن في درجات الحرارة المرتفعة إلى 600 ثانية وتكون جميع المعلمات التجريبية الأخرى هي نفسها كما في الخطوة 3.2.1.
   ملاحظه: يتم اختيار مدة فترة التوازن في درجات الحرارة المرتفعة للتجربة الثانية المرتبطة بالترابط ببساطة لضمان استنفاد الترابط بسرعة أكبر من تجربة وقت التوازن القصيرة. إذا كانت القمم المرتبطة بالترابط من التجربة الأولى تتحلل ببطء كدالة لرقم المسح (على سبيل المثال ، الاختلافات في الحد الأقصى للذروة المتتالية ≤ 0.5 درجة مئوية) ، فقم بتقدير زيادات تتراوح من 10 إلى 20 ضعفا في فترة توازن درجات الحرارة المرتفعة من أجل استنفاد الترابط بشكل كاف خلال التجربة الثانية. يتطلب الحساب الدقيق لثابت المعدل لتحويل الترابط أن يكون للتجربة الثانية استنفاد أسرع للترابط بالنسبة للأولية. ستكون تركيزات الترابط المستخرجة من التحليل العالمي للتجربتين متشابهة وبالتالي غير قابلة للاستخدام إذا لم يتم تسريع استنفاد الترابط بشكل كاف في التجربة الثانية.

4. معالجة البيانات

1. افتح ملفات تجربة DSC في برنامج تحليل بيانات DSC (راجع جدول المواد) وقم بتصدير بيانات الطاقة الأولية كجداول بيانات.
2. قم باستيراد جداول البيانات التي تحتوي على بيانات الطاقة الأولية إلى برنامج لتركيب البيانات.
خط
3. الأساس يطرح بيانات العينة عن طريق طرح بيانات طاقة المخزن المؤقت من تجارب الجزيئات الحيوية الحرة والمرتبطة بالترابط.
   ملاحظه: بالنسبة لتجربة الترابط الحراري ، يتناقص تركيز الترابط الأولي مع كل عملية فحص. لذلك ، من المثالي طرح المسح المؤقت 1 من مسح العينة 1 ، وهكذا. لقد وجدنا أن عمليات المسح العازلة بالكوكايين لا تتغير بشكل ملحوظ مع استمرار تحويل الترابط ، وبالتالي يمكن استخدام مسح عازل واحد للرابط الحراري لطرح جميع البيانات المرتبطة بالترابط الحراري.
4. قم بتحويل بيانات طاقة العينة المطروحة من خط الأساس إلى سعة حرارية.
   ملاحظه: يتطلب التحويل الحجم النوعي الجزئي للجزيء الحيوي ، والذي يمكن تقديره.

< p class = "jove_title" >5. تحليل البيانات

1. تناسب عالميا مجموعة بيانات السعة الحرارية المرتبطة بالترابط الحراري لوقت التوازن القصير مع مجموعة واحدة من معلمات خط الأساس وتركيز الترابط والطي وربط الترابط.
2. كرر الملاءمة العالمية لمجموعة بيانات وقت التوازن الطويل من أجل حساب ثابت المعدل لتحويل الترابط الحراري.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد الصوديوم كيم إمبكس #00829 ثنائي هيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة سيجما ألدريتش 71502 فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سيجما ألدريتش S9763 المياه منزوعة الانبعاثات للبيولوجيا الجزيئية ميليبور H20MB1001 مرشحات حقنة معقمة 0.2 ميكرون VWR CA28145-477 3 كيلو دالتون مرشحات الطرد المركزي ميليبور UFC900324 أنابيب غسيل الكلى 0.5-1.0 كيلو دالتون قطع مختبرات الطيف 131048 أنابيب السيليكون VWR 89068-474 أغطية شفة بلاستيكية DSC أدوات TA 6111 م أبتامر الحمض النووي MN4 تقنيات الحمض النووي المتكاملة https://www.idtdna.com/site/order/menu كوكايين سيجما ألدريتش سي 008 الكينين سيجما ألدريتش هاتف: 22620 مقياس السعرات الحرارية الدقيقة NanoDSC-III أدوات TA http://www.tainstruments.com/nanodsc/ برنامج DSCRun أدوات TA http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ برنامج NanoAnalyze أدوات TA http://www.tainstruments.com/support/software-downloads-support/instruments-by-software/ contrad-70 VWR 89233-152