$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. تحضير CXCL12 ، ومخزن الفحص المؤقت ، وخلايا Jurkat لمقايسة ربط المنافسة
- قم بإعداد محلول مخزون من CXCL12AF647 (20 ميكروغرام / مل ؛ انظر جدول المواد والكواشف) عن طريق إذابة الكاشف المجفف بالتجميد (المخزن عند -80 درجة مئوية ، في الظلام) في ماء فائق النقاء مكمل بنسبة 0.01٪ (الحجم / الحجم) من Polysorbate 20. قم بتخزين الحصص ذات الاستخدام الواحد من محلول المخزون هذا عند -80 درجة مئوية ، محمية من الضوء.
- قم بإعداد المخزن المؤقت للفحص عن طريق إضافة 40 مل من HEPES (1 م ، 20 ملي تركيز نهائي) إلى 200 مل من محلول الملح المتوازن من Hank (HBSS ، 10x ، بدون أحمر الفينول وبدون بيكربونات الصوديوم ، تركيز نهائي 1x). أضف الماء فائق النقاء للحصول على حجم نهائي قدره 2 لتر. أضف 4 جم (0.2٪ وزن / حجم) من مصل الألبومين البقري (BSA) ، وقم بإذابة BSA عن طريق التحريك المغناطيسي. أخيرا ، اضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 (استخدم هيدروكسيد الصوديوم لهذا الغرض) وقم بتصفية المحلول من خلال مسام 0.2 ميكرومتر (انظر جدول المواد والكواشف) باستخدام مشعب فراغي.
ملاحظة: سيتم إستخدام المخزن المؤقت للفحص هذا في جميع الخطوات الإضافية للبروتوكول.
- احسب عدد خلايا Jurkat وقابليتها للحياة. لهذا ، خذ عينة من تعليق الخلية وقم بتخفيفها في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
ملاحظه: نستخدم بشكل روتيني محلل حيوية الخلية الآلي (انظر جدول المواد والكواشف) القادر على حساب معلقات الخلايا بتركيزات متفاوتة. لعد الخلايا ، قم بتخفيف 0.5 مل من تعليق الخلية في 1.5 مل PBS (من الممكن أيضا التخفيفات الأخرى ، على سبيل المثال ، 0.1 مل في 1.9 مل PBS). تتوفر العديد من الأجهزة الأخرى تجاريا لحساب أرقام الخلايا والجدوى التي يجب أن تعمل بشكل جيد.
- اجمع العدد المطلوب من الخلايا (على سبيل المثال ، ~ 24 × 106 خلايا لتشغيل الفحص بلوحة واحدة كاملة ذات 96 بئرا) في أنبوب معقم سعة 50 مل عن طريق الطرد المركزي (انظر جدول المواد والكواشف لمعرفة نوع جهاز الطرد المركزي المستخدم) عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
- اسكب المادة الطافية برفق دون إزعاج حبيبات الخلية. أضف عازلة فحص جديدة (على سبيل المثال ، 20 مل) وأعد تعليق الخلايا عن طريق سحب العينات برفق لأعلى ولأسفل.
- الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
- اسكب المادة الطافية مرة أخرى وأعد تعليق حبيبات الخلية في مخزن مؤقت جديد للحصول على كثافة 5 × 106 خلايا / مل.
< p class = "jove_title" >
2. فحص ملزم للمنافسة
ملاحظة: يتم إجراء فحص ربط المنافسة الفعلي في RT ويمكن إجراؤه في ظل ظروف غير معقمة.
- قم بتخفيف المركبات قيد الفحص في مخزن مؤقت للفحص (انظر 1.2) للحصول على التركيز المطلوب. إما إعداد تركيز ثابت من المركب للفحص الأولي (على سبيل المثال ، تركيز نهائي 10 ميكرومتر) أو ، بدلا من ذلك ، سلسلة من التخفيف التسلسلي من التركيزات لتوصيف أكثر تفصيلا للمركبات (على سبيل المثال ، سلسلة تخفيف 1/3 أو 1/4 أو 1/5 تبدأ من 1 ميكرومتر ، التركيز النهائي). ضع في اعتبارنا أن المحلول المركب سيصبح في النهاية مخففا بمقدار 2x في الفحص ؛ لذلك ، قم بإعداد محلول مركز 2x.
- قم بتوزيع 100 ميكرولتر من المحلول المركب (2x مركز) في صفيحة سفلية مستديرة شفافة مكونة من 96 بئرا (انظر جدول المواد والكواشف) وفقا لتخطيط تجريبي محدد مسبقا (على سبيل المثال ، الشكل 1C).
ملاحظة: في هذه المرحلة ، يتم تضمين عينات التحكم السلبية والإيجابية في الفحص. في عينة التحكم السلبية ، تتم إضافة 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص بدلا من المركب إلى آبار الصفيحة المكونة من 96 بئرا. بالنسبة لعينة التحكم الإيجابية، تتم إضافة مخزن مؤقت للفحص أيضا خلال هذه الخطوة. انظر أيضا الشكل 1C للحصول على تخطيط تجريبي نموذجي يتم فيه اختبار سلسلة تخفيف من عدة مركبات.
- أضف 50 ميكرولتر من معلق الخلية (انظر 1.7؛ 0.25 × 106 خلايا) من خزان كاشف إلى صفيحة 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة القنوات. احتضن الطبق لمدة 15 دقيقة في RT في الظلام.
- أضف 50 ميكرولتر من CXCL12 المسمى بالفلورسنت (أي 100 نانوغرام / مل من CXCL12AF647 في المخزن المؤقت للفحص ، 4x مركز ، 25 نانوغرام / مل التركيز النهائي) من خزان كاشف مماثل إلى آبار لوحة 96 بئرا. احتضن لمدة 30 دقيقة في RT في الظلام.
ملاحظه: بالنسبة لعينات التحكم السلبية، أضف المخزن المؤقت للمقايسة بدلا من ذلك. ومن ثم ، فإن إشارة الفلورسنت المكتشفة في عينات التحكم السالبة ستتوافق مع إشارة خلفية الفلورسنت الذاتي (الشكل 1 أ). بالنسبة لعينات التحكم الإيجابية ، أضف 50 ميكرولتر / بئر من CXCL12AF647. ستنتج عينات التحكم الإيجابية أقصى إشارة مضان تم اكتشافها نظرا لعدم تضمين أي تثبيط محتمل عن طريق الحضانة المسبقة بالمركبات (الشكل 1 أ).
- جهاز الطرد المركزي للوحة 96 بئرا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في RT. قم بإزالة المادة الطافية من الخلايا المحببة عن طريق التقليب فوق اللوحة. جفف الطبق على منديل ورقي.
- أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت للفحص الطازج من خزان الكاشف إلى الآبار باستخدام ماصة متعددة القنوات. تابع على الفور.
قم - بالطرد المركزي للوحة مرة أخرى لمدة 5 دقائق عند 400 × جم عند RT. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق التقليب فوق اللوحة وتجفيفها مرة أخرى على منديل ورقي.
- أعد تعليق حبيبات الخلية برفق في 200 ميكرولتر من 1٪ بارافورمالدهيد المذاب في PBS. ستعمل هذه الخطوة على إصلاح الخلايا.
- استمر في البروتوكول على الفور مع القياس الكمي للتألق عن طريق قياس التدفق الخلوي.
< p class = "jove_title" >
3. تحليل العينات عن طريق قياس التدفق الخلوي
CXCL12AF647 الخلايا الملطخة والمثبتة جاهزة الآن للتحليل باستخدام قياس التدفق الخلوي. يمكن استخدام عدة أنواع من مقاييس التدفق الخلوي ، ولكن يجب أن تكون مجهزة بالليزر الصحيح (أي ليزر أحمر ، نطاق الإثارة ~ 630 نانومتر) للإثارة والمرشحات المناسبة للكشف عن الفلوروفور (مرشحات الانبعاث ~ 660 نانومتر). يجب أن يكونوا قادرين على التعامل مع العينات في شكل لوحة 96 بئرا. يتم إعطاء أمثلة على أجهزة قياس التدفق الخلوي المناسبة في جدول المواد والكواشف.
- قم ببدء تشغيل الجهاز وافتح البرنامج المقابل (انظر جدول المواد والكواشف).
- حدد المعلمات الخلوية التالية المراد تصورها بتنسيق لطخة نقطية: التشتت الأمامي (FSC) ، والمبعثر الجانبي (SSC) ، وقناة الكشف عن الفلوروفور (CXCL12AF647).
ملاحظه: باستخدام معلمة FSC ، يتم تمييز الخلايا بناء على حجمها ، حيث يتناسب امتصاص الضوء المكتشف مع قطر الخلية. توفر معلمة SSC ، التي تقيس تشتت الضوء بزاوية 90 درجة ، معلومات حول دقة الخلايا.
- اختر عينة واحدة (على سبيل المثال ، عينة تحكم سلبية) لإجراء بوابات لمجموعة خلايا متجانسة محددة بناء على معلمات FSC و SSC.
- حدد الحقن التلقائي ~ 100 ميكرولتر من الخلايا الثابتة من عينة التحكم السلبية هذه في مقياس التدفق الخلوي. حدد خيار "الخلط" قبل الحقن واستخدم معدل تدفق عينة يبلغ 1.5 ميكرولتر / ثانية.
- قم بتشغيل هذا النموذج عن طريق تحديد "الحصول على البيانات". ستظهر الآن معلمات FSC و SSC لهذا النموذج على الشاشة.
- حدد أداة بوابة البرنامج. استنادا إلى تصور اللطخة النقطية FSC و SSC ، حدد مسبقا مجموعة خلايا متجانسة وقابلة للحياة عن طريق البوابة. للقيام بذلك ، قم بإنشاء مضلع (باستخدام أداة بوابة البرنامج) يتضمن الخلايا المفردة الموزعة بشكل متجانس ("الأحداث") بناء على هذين البعدين.
ملاحظه: يهدف إجراء البوابات إلى تحديد مجموعة خلايا متجانسة وقابلة للحياة سيتم استخدامها لمزيد من التحليل. يعتمد البوابات على افتراض أن غالبية الخلايا القابلة للحياة ستشكل مجموعة خلايا متجانسة بناء على معلمات FSC و SSC. من خلال تنفيذ هذه الخطوة ، يمكن استبعاد الحطام الخلوي والخلايا الميتة ومجاميع الخلايا إلى حد كبير من مزيد من التحليل. يتم إعطاء توضيح لعملية البوابات في الشكل 1 ب.
- حدد لتحليل 20,000 "حدث" (أي خلايا مفردة) لكل عينة.
ملاحظه: هذا يعني أنه لكل عينة ، سيتم تحليل 20,000 خلية تقع ضمن البوابة المحددة مسبقا في النهاية. سيستمر الحصول على البيانات لكل عينة حتى يتم تحليل هذا العدد من الأحداث.
- ابدأ التشغيل (حدد "تسجيل البيانات"). سيقوم جهاز قياس التدفق الخلوي الآن بتحليل جميع العينات واحدة تلو الأخرى عن طريق تسجيل متوسط شدة التألق (MFI) لكل عينة. يتوافق هذا MFI مع متوسط إشارة الفلورسنت المقابلة ل 20,000 خلية تقع ضمن البوابة المحددة مسبقا.
