اختبار مراسل قائم على ELISA لدراسة تفاعل المستقبل والترابط في خلايا BW

الملخص

المصدر: Elias، S. et al. ، A BW Reporter System لدراسة تفاعلات المستقبلات والترابط. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو الكشف المستند إلى مقايسة المراسل للتفاعل بين المستقبل والترابط. ينشط التفاعل الناجح بين المستقبل والترابط مسار الإشارات النهائية ، مما يتسبب في توليد وإطلاق السيتوكينات كجزيئات مراسل إفرازي في المحلول ، وهو ما يتم تأكيده باستخدام ELISA.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد البلازميد الذي يعبر عن البناء الخيالي

ملاحظة: الهدف هو توليد بلازميد يعبر عن المجال خارج الخلية لمستقبل الاهتمام المدمجة في المجالات عبر الغشاء وداخل الخلايا لسلسلة CD3ζ للفأر (الشكل 1 أ).

1. استرجع تسلسل المجال خارج الخلية للمستقبل محل الاهتمام بما في ذلك ببتيد الإشارة. الحصول على مادة الحمض النووي التي من المتوقع أن تعبر عن هذا المستقبل (على سبيل المثال ، كدنا) أو البلازميد).
2. احصل على مادة الحمض النووي التي تعبر عن الغشاء والمجالات داخل الخلايا لسلسلة CD3ζ للفأر (على سبيل المثال ، cDNA أو البلازميد).
3. صمم تسلسل بروتين الاندماج ....

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: هيكل المستقبل الخيمري CD3ζ وتصميم بادئات PCR. (أ) الهيكل العام لمستقبل خارج الخلية المدمجة في المجالات عبر الغشاء وداخل الخلايا للفأر CD3ζ. (ب) تم تضخيم المجال خارج الخلية للمستقبل باستخدام برايمر 3 'والذي تضمن أيضا نيوكليوتيدات CD3ζ. (ج) تم تضخيم المجالات داخل الخلايا والأغشية ل CD3ζ باستخدام برايمر 5 بوصات تضمن أيضا نيوكليوتيدات المستقبلات. (د) في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلس.......

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات AccuPrep ، طقم استخراج البلازميد الصغير بيونير ك -3030 مضاد للفأر IL-2 بيو ليجند 503702 البيوتين المضاد للفأر IL-2 بيو ليجند 503804 لوحات ELISA دي جروت 60-655061 مصل الأبقار الجنينية سيغما F7524-500 مل جي 418 زئبق MBS3458105GM الجين النابض الثاني بيو راد 165-2105 ، 165-2106 ، 165-2107 ، 165-2108 ، 165-2109 ، 165-2110 ل-جلوتامين الصناعة البيولوجية 03-020-1 ب محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM الصناعة البيولوجية 01-340-1 ب محلول البنسلين والستربتومايسين الصناعة البيولوجية 03-031-1 ب بيروكسيداز ستربتافيدين جاكسون للأبحاث المناعية 016-030-084 طقم PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep ثيرموفيشر العلمي K210016 RPMI-1640 متوسط الصناعة البيولوجية 30-2001 بيروفات الصوديوم الصناعة البيولوجية 03-042-1 ب TMB ساوثرن بيوثيك 0410-01