اختبار مراسل قائم على ELISA لدراسة تفاعل المستقبل والترابط في خلايا BW

الملخص

المصدر: Elias، S. et al. ، A BW Reporter System لدراسة تفاعلات المستقبلات والترابط. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو الكشف المستند إلى مقايسة المراسل للتفاعل بين المستقبل والترابط. ينشط التفاعل الناجح بين المستقبل والترابط مسار الإشارات النهائية ، مما يتسبب في توليد وإطلاق السيتوكينات كجزيئات مراسل إفرازي في المحلول ، وهو ما يتم تأكيده باستخدام ELISA.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد البلازميد الذي يعبر عن البناء الخيالي

ملاحظة: الهدف هو توليد بلازميد يعبر عن المجال خارج الخلية لمستقبل الاهتمام المدمجة في المجالات عبر الغشاء وداخل الخلايا لسلسلة CD3ζ للفأر (الشكل 1 أ).

1. استرجع تسلسل المجال خارج الخلية للمستقبل محل الاهتمام بما في ذلك ببتيد الإشارة. الحصول على مادة الحمض النووي التي من المتوقع أن تعبر عن هذا المستقبل (على سبيل المثال ، كدنا) أو البلازميد).
2. احصل على مادة الحمض النووي التي تعبر عن الغشاء والمجالات داخل الخلايا لسلسلة CD3ζ للفأر (على سبيل المثال ، cDNA أو البلازميد).
3. صمم تسلسل بروتين الاندماج بناء على الهيكل العام الموضح في الشكل 1 أ. تأكد من أن التسلسل بأكمله داخل نفس إطار قراءة الكودون. يستخدم هذا التسلسل لتصميم الاشعال المناسبة والتحقق من المنتج النهائي.
4. صمم تفاعلين تفاعلي تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم كل جزء من أجزاء بروتينات الاندماج بشكل منفصل (الشكل 1 ب ، 1 ج).< / > ملاحظه: تعتمد الشروط المحددة لتفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل (على سبيل المثال ، وقت الاستطالة ودرجة حرارة التلدين) على طبيعة البادئات المصممة لمستقبل معين.
   1. تضخيم الجزء خارج الخلية من المستقبل.
      1. صمم برايمر 5 بوصات يتضمن جزءا من ببتيد إشارة المستقبل ، وتسلسل إجماع كوزاك ، وموقع تقييد مناسب (الشكل 1 ب).
      2. صمم برايمر 3 بوصات يحيط بكلا الجزأين من بروتين الاندماج (الشكل 1 ب). على سبيل المثال ، بالنسبة للتصميم الأولي ، يمكن أن يشتمل هذا التمهيدي 3 بوصات على آخر 20 زوجا أساسيا من الجزء خارج الخلية للمستقبل وأول 9 أزواج أساسية من مقطع CD3ζ.
         ملاحظه: ليست هناك حاجة لإضافة موقع تقييد إلى التمهيدي 3 'حيث سيتم استخدام هذا التمهيدي لإنشاء التسلسل المنصهر ، ولا يتم استخدامه للربط.
   2. تضخيم جزء CD3ζ.
      1. صمم برايمر مقاس 5 بوصات يحيط بكلا الجزأين من بروتين الاندماج (الشكل 1 ج). على سبيل المثال ، بالنسبة للتصميم الأولي ، يمكن أن يشتمل التمهيدي 5 بوصات على آخر 9 أزواج أساسية من الجزء خارج الخلية للمستقبل وأول 20 زوجا أساسيا من مقطع CD3ζ.
         ملاحظه: ليست هناك حاجة لإضافة موقع تقييد إلى التمهيدي 5 بوصات حيث سيتم استخدام هذا التمهيدي لإنشاء التسلسل المنصهر ، ولا يتم استخدامه للربط.
      2. صمم برايمر 3 بوصات يتضمن نهاية تسلسل CD3ζ بالإضافة إلى موقع تقييد مناسب (الشكل 1 ج).
   3. قم بتصحيح التسلسلات التمهيدية في كل من هذين التفاعلين بحيث تكون درجة حرارة التلدين متشابهة في كل زوج (لاحظ أن التمهيدي ، الذي يتضمن تسلسلات من جزأين من بروتين الاندماج ، فقط الصلب مع جزء من التسلسل في كل تفاعل).
5. قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل الإضافي حيث يتم استخدام خليط من منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل للتفاعلين الأولين كقالب الحمض النووي مع التمهيدي 5 'لجزء المستقبل خارج الخلية (الخطوة 1.4.1.1) و 3' من مقطع CD3ζ (الخطوة 1.4.2.2) (الشكل 1 د). يجب أن يولد هذا التفاعل التسلسل النهائي المنصهر.
6. المضي قدما كالمعتاد للاستنساخ.
   1. ربط منتج PCR النهائي بناقل القطع المستهدف (عادة ما يكون المتجه المستهدف هو pcDNA3 الذي يعبر عن G418 ومقاومة الأمبيسيلين).
   2. تحويل الناقل المرتبط إلى بكتيريا مختصة.
      1. قم بإذابة 50 ميكرولتر من البكتيريا المختصة على الجليد.
      2. أضف الناقل المرتبط إلى البكتيريا واحتضنه على الجليد لمدة 20 دقيقة.
      3. احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية.
      4. أضف 200 ميكرولتر من LB بدون مضادات حيوية.
      5. احتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر.
      6. البذور على طبق LB مع المضادات الحيوية المناسبة (على سبيل المثال ، محلول الأمبيسلين بتركيز نهائي قدره 0.1 مجم / مل).
   3. اجمع وتنمو العديد من المستعمرات البكتيرية في 5 مل من LB (في أنابيب 15 مل).
   4. في اليوم التالي ، استخرج البلازميدات باستخدام مجموعة تحضير صغيرة.
   5. تحليل إدخال الجين باستخدام إنزيمات التقييد.
   6. تسلسل المستعمرات ذات الصلة والتحقق من صحة التسلسل وإطار القراءة (كما هو موضح في الخطوة 1.3).
7. تحويل البلازميد الذي تم التحقق منه إلى بكتيريا مختصة.
   1. قم بإذابة 20 ميكرولتر من البكتيريا المختصة على الجليد.
   2. أضف 1 ميكرولتر من البلازميد إلى البكتيريا واحتضن على الثلج لمدة 20 دقيقة.
   3. احتضان عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية.
   4. أضف 200 ميكرولتر من LB بدون مضادات حيوية.
   5. احتضان لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز المستمر.
   6. البذور على صفيحة نمو بكتيرية مع المضادات الحيوية المناسبة (على سبيل المثال ، محلول الأمبيسلين بتركيز نهائي قدره 0.1 مجم / مل).
8. في اليوم التالي ، قم بزراعة مستعمرة بكتيرية في وعاء كبير من LB يحتوي على 0.1 مجم / مل أمبيسلين (~ 250 مل).
9. في اليوم التالي ، قم بإجراء الإعداد الماكسي وفقا للتعليمات المحددة التي توفرها المجموعة.
   ملاحظه: بالنسبة لإجراء التثقيب الكهربائي ، يلزم وجود كمية كبيرة من البلازميد ، كما هو مفصل أدناه.

< p class = "jove_title" >2. تعداء البلازميد الذي يعبر عن البروتين الخيمري في خلايا BW

< p class = "jove_content" >ملاحظة: يمكن أيضا استخدام طرق مختلفة للتعدي (على سبيل المثال ، عن طريق العدوى الفيروسية العدسية). قبل التثقيب الكهربائي ، قم بإجراء ترسيب الإيثانول للحمض النووي كما هو موضح أدناه. تتطلب الخطوات التالية ظروفا معقمة.

1. في اليوم السابق ، قم بإعداد خلايا BW5147 ("خلايا BW") للتثقيب الكهربائي. صفيحة 10 أطباق (10 سم) تحتوي على 10 مل من 100,000 خلية BW5147 / مل (أي ما مجموعه 10 × 10⁶ خلايا) مع RPMI مكمل بمصل ربلة الساق الجنينية 10٪ وبيروفات الصوديوم 1٪ و1٪ ل-جلوتامين و1٪ من الأحماض الأمينية غير الأساسية و1٪ بنسلين ستربتومايسين ("وسط كامل").
2. ضع 100 ميكروغرام من بلازميد pcDNA3 الذي يعبر عن بروتين الاندماج في أنبوب 1.5-2 مل وأضف 3 M من أسيتات الصوديوم عند درجة الحموضة 5.3-5.5 إليه. يجب أن يتوافق حجم أسيتات الصوديوم مع 0.1 (10٪) من حجم 100 ميكروغرام البلازميد ؛ قم بمعايرة درجة الحموضة في أسيتات الصوديوم بمقياس الأس الهيدروجيني عن طريق إضافة هيدروكسيد الصوديوم أو حمض الهيدروكلوريك
3. أضف 2.5 حجم من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى خليط البلازميد وخلات الصوديوم كما هو موضح في الخطوة 2.2 (2.5 ضعف الحجم الكلي للبلازميد وخلات الصوديوم). احتضن طوال الليل عند -20 درجة مئوية أو لمدة ساعتين عند 70 درجة مئوية.
4. بعد 24 ساعة من طلاء خلايا BW ، اجمع جميع خلايا BW (~ 100 مل) في 2 50 مل من الأنابيب. قم بالطرد المركزي للخلايا لمدة 5 دقائق عند 515 × جم وتخلص من المادة الطافية.
5. أعد تعليق الحبيبات من كلا الأنبوبين في 25 مل من RPMI- في أنبوب واحد 50 مل. على سبيل المثال ، أعد تعليق حبيبات أنبوب واحد مع 25 مل من RPMI- ثم استخدم هذا السائل لإعادة تعليق السائل في الأنبوب الآخر 50 مل بحيث يتم إعادة تعليق الحبيبات الكلية من خلايا BW في 25 مل من الوسط في أنبوب واحد.
   ملاحظه: يجب أن يكون الوسيط بدون إضافات لأن المصل قد يتداخل مع التثقيب الكهربائي.
6. الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى لمدة 5 دقائق عند 515 × جم. أعد تعليق الحبيبات في 1 مل من RPMI, وانقل المحتويات إلى كوفيت 0.4 سم على الجليد.
7. الطرد المركزي البلازميد الذي خضع لهطول الأمطار الإيثانول (الخطوة 2.3) لمدة 30 دقيقة عند 16,000 × جم و 4 درجات مئوية.
8. يغسل مرة واحدة ب 1 مل من 70٪ من الإيثانول وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة أخرى عند 16,000 × جم و 4 درجات مئوية (لغسل الملح).
9. قم بإزالة كل الإيثانول واترك الحبيبات تجف قليلا (أي في أنبوب مفتوح في غطاء زراعة الأنسجة). أعد تعليق الحبيبات ب 100 ميكرولتر من RPMI- تم تسخينها مسبقا إلى 60 درجة مئوية.
10. أضف البلازميد المعاد تعليقه (الخطوة 2.8) إلى الخلايا الموجودة في الكوفيت واحتضنه لمدة 5 دقائق على الجليد.
قم
11. بالكهرباء للخلايا عند 0.23 كيلو فولت ، 250 سعة. يجب أن يستغرق هذا ~ 4 مللي ثانية.
12. انقل الخلايا الكهربائية إلى أنبوب سعة 50 مل ، وأضف 50 مل من الوسط الكامل ، وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 5,15 × جم.
13. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا ب 50 مل من الوسط الكامل.
14. قم بتغطية الخلايا المثقبة بالكهرباء في أطباق استزراع 24 بئرا (1 مل لكل بئر ، ليصبح المجموع ~ 50 بئرا) واحتضانها عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 48 ساعة.
15. حدد الخلايا المنقولة بالمضادات الحيوية. بعد 48 ساعة ، أضف 1 مل من الوسط الكامل المكمل ب 10 مجم / مل G418 لكل بئر (في هذه المرحلة الحجم النهائي في كل بئر هو 2 مل والتركيز النهائي ل G418 في كل بئر هو 5 مجم / مل).
    ملاحظه: إذا كان البلازميد يحتوي على مقاومة مختلفة للمضادات الحيوية ، فحدد تركيز المضادات الحيوية المطلوب لقتل خلايا BW غير المنقولة قبل هذه الخطوة.
16. كل 48 ساعة ، تخلص بعناية من 1 مل من الحجم العلوي لكل بئر دون تحريك الوسط في البئر (تميل خلايا BW إلى أن تكون في قاع البئر). أضف وسطا كاملا مكملا ب 5 مجم / مل G418 إلى كل بئر ، بحيث يكون الحجم النهائي في كل بئر 2 مل مرة أخرى.
17. افحص ألواح الاستزراع لنمو الخلايا في جميع الآبار بانتظام.
    ملاحظه: قد يساعد تغيير لون الوسط إلى الأصفر في تحديد الخلايا النامية. ومع ذلك ، في البداية ، سيكون الوسيط أصفر بسبب G418 نفسه. تحديد الآبار الإيجابية (الآبار ذات الخلايا النامية). هذه الآبار مقاومة ل G418 وبالتالي من المتوقع أن تعبر عن بروتين الاندماج. تستغرق هذه العملية عادة ~ 3 أسابيع.

< p class = "jove_title" >3. التحقق من التعبير عن المستقبل المنقول في الخلايا في الآبار الموجبة.

1. تلطخ خلايا BW المنقولة بجسم مضاد محدد ضد المستقبل الذي تم نقله.
2. قارن مستوى تعبير المستقبل عن طريق قياس التدفق الخلوي بتعبير خلايا التحكم (خلايا BW غير المنقولة).
3. بعد التحقق من بئر واحد أو أكثر ، استخدم الخلايا على الفور لأغراض تجريبية ، أو قم بزراعتها في الثقافة ، أو قم بتجميدها للتطبيقات المستقبلية.
4. تحقق من تعبير المستقبل المنقول قبل إجراء تجربة جديدة. بعد بضعة أسابيع من النمو ، يمكن حذف الخلايا التي تحتوي على G418 ذات تعبير مستقبلات مستقر ، G418 من وسط الثقافة.

< p class = "jove_title" >4. حضانة خلايا BW المنقولة بالأهداف

ملاحظة: عند استخدام خلايا BW المنقولة لأول مرة ، يفضل اختبارها على أهداف تعبر عن رابط معروف للمستقبل محل الاهتمام أو على أجسام مضادة مرتبطة بلوحة موجهة خصيصا ضد المستقبل محل الاهتمام (تجارب الربط المتقاطع ؛ انظر أدناه ، القسم 4.2.1.3).

1. يفضل تقسيم خلايا BW قبل 24 ساعة من التجربة (على سبيل المثال ، عن طريق إضافة 10 مل من الوسط الكامل إلى 2 مل من الخلايا في الثقافة في صفيحة ثقافة جديدة مقاس 10 سم).
2. احتضان خلايا BW المنقولة بأهدافها. قم بإجراء التجربة في وقت واحد على خلايا BW للتحكم التي تعبر عن متجه فارغ (أو خلايا BW الأبوية). يفضل استخدام لوحات 96F (ولكن يمكن أيضا استخدام لوحات 96U). قم بإجراء التجربة في ثلاث نسخ. قم بتعليق جميع الخلايا في الوسط الكامل.
   1. جهز الأهداف. يختلف نوع الهدف كدالة للهدف ويمكن أن يكون خلايا أو خلايا تم تحضينها مسبقا بالأجسام المضادة أو الأجسام المضادة وحدها. تم استخدام هذا النظام أيضا مع البكتيريا كأهداف.
      1. إذا كانت الأهداف تقسم الخلايا (أي خطوط الخلايا) ، فقم بإشعاعها عند 6,000 راد قبل الفحص. ضع 50.000 من الخلايا المستهدفة في بئر واحد من 96 صفيحة (بحجم 100 ميكرولتر).
      2. بالنسبة للتجارب على الأجسام المضادة وخلايا BW التي تعبر عن FcγRs البشري ، احتضان الخلايا المستهدفة بجسم مضاد على الجليد في صفيحة مكونة من 96 بئرا (على سبيل المثال ، 50 ميكرولتر من الخلايا المستهدفة و 50 ميكرولتر من الجسم المضاد ؛ يمكن اختبار جرعات مختلفة من الأجسام المضادة).
      3. إذا كنت تستخدم الأجسام المضادة وحدها كأهداف (تجارب الربط المتبادل) ، فيجب أن تكون مرتبطة باللوحة. لهذا الغرض ، قم أولا باحتضان الأجسام المضادة في وسط كامل في صفيحة 96F لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2} (جرعة البداية النموذجية هي 0.5 ميكروغرام من جسم مضاد معين في 50 ميكرولتر). اغسل اللوحة لإزالة الأجسام المضادة غير المرتبطة.
         ملاحظه: في هذه الحالة ، ستمكن لوحة 96F من ربط الجسم المضاد باللوحة ، والتي ستؤدي بعد إضافة خلايا BW المنقولة إلى تنشيط المستقبل المنقول.
   2. أضف خلايا BW (خلايا المستجيب). ضع 50,000 خلية BW في بئر واحد من 96 صفيحة (بحجم 100 ميكرولتر).
   3. أكمل الحجم في كل بئر إلى 200 ميكرولتر إذا لزم الأمر.
   4. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 48 ساعة (يمكن معايرة هذه الفترة الزمنية).
3. بعد 48 ساعة ، قم بتجميد الألواح عند -20 درجة مئوية وإذابتها قبل ELISA ، أو استخدمها على الفور في ELISA (انظر الخطوات التالية).

< p class = "jove_title" >5. إليزا

1. قم بتغطية لوحة ELISA بجسم مضاد IL-2 مضاد للفأر (مضاد ل mIL-2). ضع 0.05 ميكروغرام من مضاد mIL-2 بحجم 50 ميكرولتر من 1x PBS (محلول ملحي عازل للفوسفات) لكل بئر. احتضان لوحة ELISA المطلية بالجسم المضاد ل mIL-2 عند 4 درجات مئوية طوال الليل أو عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة < br / > ملاحظه: لإجراء ELISA مباشرة بعد خطوة الحضانة ، يجب طلاء لوحة ELISA قبل 24 ساعة من نهاية فترة حضانة خلايا BW.
2. تخلص من السائل في لوحة ELISA وأضف محلول مانع (200 ميكرولتر لكل بئر) يتكون من 1x PBS و 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA). احتضان لوحة ELISA لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
3. اغسل لوحة ELISA ثلاث مرات بمحلول PBS Tween بنسبة 0.05٪ (أي 0.5 مل من Tween-20 في 1 لتر من 1x PBS).
4. خذ اللوحة 96 التي تحتوي على خلايا BW التي تم تحضينها بأهدافها (4.3). إذا تم تجميد الصفيحة ، فقم بإذابة الثلج تماما (على سبيل المثال ، عن طريق الحضانة القصيرة عند 37 درجة مئوية). جهاز الطرد المركزي للوحة 96 بئرا (5 دقائق ، 515 × جم) وانقل بعناية 100 ميكرولتر من المادة الطافية في كل بئر إلى لوحة ELISA المطلية مسبقا والمسدودة.
   ملاحظه: يجب جمع المادة الطافية من جوانب كل بئر لتجنب أخذ الخلايا.
5. إذا رغبت في ذلك ، أضف mIL-2 المؤتلف بتركيزات محددة إلى أحد الصفوف الفارغة من لوحة ELISA المطلية لتوليد منحنى قياسي ل mIL-2. على سبيل المثال ، ابدأ من تركيز mIL-2 البالغ 2,500 بيكوغرام / مل ثم انخفض بنسبة 50٪ في كل بئر لاحق ؛ لا تضيف mIL-2 إلى البئر الأخير.
6. احتضان لوحة ELISA عند 4 درجات مئوية طوال الليل أو عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين.
7. اغسل لوحة ELISA أربع مرات باستخدام PBS Tween.
8. أضف البيوتين IL-2 المضاد للفأر إلى لوحة ELISA. استخدم تركيزا 1 ميكروغرام من الجسم المضاد في 1 مل من 1x PBS مع 1٪ BSA وقسمها إلى 100 ميكرولتر لكل بئر.
9. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
10. اغسل لوحة ELISA ست مرات باستخدام PBS Tween.
11. أضف الستربتافيدين المترافق ب HRP. استخدم تركيز 1 ميكرولتر من الستربتافيدين في 1 مل من PBSX1 مع 1٪ BSA وقسمه إلى 100 ميكرولتر لكل بئر.
12. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
13. اغسل لوحة ELISA ست مرات باستخدام PBS Tween.
14. أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من محلول الركيزة TMB. أكمل هذه المرحلة بسرعة لتقليل الاختلافات بين الآبار بسبب التأخر الزمني عند إضافة TMB.
15. اقرأ لوحة ELISA باستخدام قارئ لوحة ELISA عند 650 نانومتر (يمكن تكرار القراءة إذا كانت الإشارة ضعيفة).

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: هيكل المستقبل الخيمري CD3ζ وتصميم بادئات PCR. (أ) الهيكل العام لمستقبل خارج الخلية المدمجة في المجالات عبر الغشاء وداخل الخلايا للفأر CD3ζ. (ب) تم تضخيم المجال خارج الخلية للمستقبل باستخدام برايمر 3 'والذي تضمن أيضا نيوكليوتيدات CD3ζ. (ج) تم تضخيم المجالات داخل الخلايا والأغشية ل CD3ζ باستخدام برايمر 5 بوصات تضمن أيضا نيوكليوتيدات المستقبلات. (د) في تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلس...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات AccuPrep ، طقم استخراج البلازميد الصغير بيونير ك -3030 مضاد للفأر IL-2 بيو ليجند 503702 البيوتين المضاد للفأر IL-2 بيو ليجند 503804 لوحات ELISA دي جروت 60-655061 مصل الأبقار الجنينية سيغما F7524-500 مل جي 418 زئبق MBS3458105GM الجين النابض الثاني بيو راد 165-2105 ، 165-2106 ، 165-2107 ، 165-2108 ، 165-2109 ، 165-2110 ل-جلوتامين الصناعة البيولوجية 03-020-1 ب محلول الأحماض الأمينية غير الأساسية MEM الصناعة البيولوجية 01-340-1 ب محلول البنسلين والستربتومايسين الصناعة البيولوجية 03-031-1 ب بيروكسيداز ستربتافيدين جاكسون للأبحاث المناعية 016-030-084 طقم PureLink HiPure Plasmid Filter Maxiprep ثيرموفيشر العلمي K210016 RPMI-1640 متوسط الصناعة البيولوجية 30-2001 بيروفات الصوديوم الصناعة البيولوجية 03-042-1 ب TMB ساوثرن بيوثيك 0410-01