$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. عزل كرات الدم الحمراء البشرية ، والبيوتينيل ، وتعديل الأسمولية
ملاحظة: يجب تنفيذ الخطوة 1.1 من قبل أخصائي طبي مدرب مثل ممرضة ، مع بروتوكول معتمد من مجلس المراجعة المؤسسية.
- احصل على 8-10 ميكرولتر (قطرة واحدة) من الدم من وخز الإصبع وأضفه إلى 1 مل من المخزن المؤقت للكربونات / البيكربونات (قائمة المواد). قم بدوامة أو ماصة الخليط وجهاز الطرد المركزي برفق لمدة 1 دقيقة عند 900 × جم. تخلص من المادة الطافية واغسلها مرة أخرى.
- في دورق صغير ، تزن 3.5-4 مجم من رابط البيوتين - PEG3500 - NHS (قائمة المواد). قم بإذابته في المخزن المؤقت للكربونات / البيكربونات لجعل التركيز النهائي 3 مجم / مل.
- امزج 171 ميكرولتر من محلول الكربونات / البيكربونات ، و 10 ميكرولتر من عبوة كرات الدم الحمراء ، و 1049 ميكرولتر من محلول رابط البيوتين PEG3500-NHS واحتضنه في RT لمدة 30 دقيقة. اغسل كرات الدم الحمراء مرة واحدة باستخدام محلول كربونات / بيكربونات ثم مرتين باستخدام مخزن N2-5٪ (قائمة المواد).
- في هذه الأثناء ، ضع زجاجة الرابط بغطاء مفكك في مجفف زجاجي مملوء بالمجففات في الأسفل ومكنسة كهربائية لمدة 5 دقائق ، واملأ المجفف بالأرجون. شد الغطاء وأخرج الزجاجة. أغلق الزجاجة بغشاء بارافين بلاستيكي (قائمة المواد) ، ضعها في وعاء مملوء بالمجففات في الأسفل ، وقم بتخزينها عند -20 درجة مئوية
ملاحظه: يجب تنفيذ الخطوات التي تتضمن استخدام رابط البيوتين PEG3500-NHS ، بما في ذلك 1.2-1.4 (باستثناء الحضانة والغسيل في 1.3) ، في أسرع وقت ممكن.
- قم بتخفيف النيستاتين في محلول N2-5٪ لعمل تركيز نهائي يبلغ 40 ميكروغرام / مل. امزج 5 ميكرولتر من كرات الدم الحمراء الحيوية مع 71.4 ميكرولتر من محلول النيستاتين (قائمة المواد) واحتضنه لمدة ساعة واحدة عند 0 درجة مئوية. يغسل مرتين باستخدام محلول N2-5٪ ويخزن مع N2-5٪ عازلة + 0.5٪ BSA (قائمة المواد) في الثلاجة (4 درجات مئوية).
فئة < p = "jove_title" >
2. السيلانة الزجاجية
- تنظيف سطح الخرزة
- تزن 50 مجم من مسحوق الخرز الزجاجي وأعد تعليقها في 500 ميكرولتر من ماء DI.
- امزج 0.5 مل من 30٪ H2O2 (قائمة المواد) مع 9.5 مل من ماء DI في دورق سعة 50 مل ، ثم أضف 2 مل من NH4OH المركز (قائمة المواد) وأحضر هذا المحلول إلى غلاية على طبق ساخن.
- أضف الخرزات الزجاجية إلى محلول الغليان واستمر في الغليان لمدة 5 دقائق أخرى.
- بعد الغليان ، انقل ~ 5 مل من معلق الخرزة الساخنة هذا إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 15 مل وقم بتغطيته بماء RT DI. جهاز طرد مركزي عند 3,500 × جم لمدة 5 دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية والتخلص منها.
- انقل 5 مل أخرى من معلق الخرز الساخن وأضفه إلى الخرز المغسول ، وقم بتعبئته بمزيد من ماء DI ، واخلطه جيدا ، وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى. كرر هذا الإجراء حتى يتم استخدام حوالي 50 مل من ماء DI ، والذي سيكون ما مجموعه 4 إلى 5 مرات من الغسيل.
- انقل معلق الخرزة إلى قارورة سعة 1 مل. كرر غسل الخرزات بالميثانول (قائمة المواد) عن طريق الطرد المركزي عند 17,000 × جم لمدة 5 دقائق 3 مرات ، وأخيرا أعد تعليق الخرزات في 1 مل من الميثانول بنسبة 100٪.
- حبة سطح الثيوليون
- أضف إلى أنبوب الطرد المركزي سعة 50 مل 45.6 مل من الميثانول ، و 0.4 مل من حمض الأسيتيك (قائمة المواد) ، و 1.85 مل من ماء DI ، و 1.15 مل من 3- Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) (قائمة المواد) و 1 مل معلق الخرز المحضر في 2.1 ، ثم احتضانه في RT لمدة 3 ساعات.
- بعد التفاعل ، قم بإزالة جميع المواد المتفاعلة عن طريق غسلها مرة واحدة بالميثانول الطازج ، وأعد تعليق الخرزات في 500 ميكرولتر من الميثانول. قسم تعليق الخرز الزجاجي المركز هذا بالتساوي إلى مجموعة من 20 قارورة زجاجية جافة ونظيفة مع أغطية لولبية. تبخر الميثانول باستخدام نفاثة من الأرجون الجاف وقم بتدوير القوارير ببطء لعمل طبقة رقيقة من الخرز الجاف على جوانب كل قارورة.
- ضع قوارير الخرز في فرن تجفيف مسخن مسبقا على حرارة 120 درجة مئوية لمدة 5 دقائق ثم أخرجها وضع الغطاء (الأغطية) بسرعة بشكل غير محكم. ضع القوارير في مجفف زجاجي مملوء بالمجففات في الأسفل وقم بتفريغ المجفف بمضخة تفريغ حتى يبرد.
- قم بتطهير المجفف بالمكنسة الكهربائية بالأرجون الجاف لإحضار المجفف إلى الضغط الجوي الطبيعي. قم بإزالة غطاء المجفف وأعد شد الغطاء (الأغطية) الموجودة على القارورة بسرعة. أغلق القوارير بغشاء بارافين بلاستيكي واحفظها في RT في صندوق تخزين جاف وداكن.
- عند الاستخدام الفوري ، خذ قارورة واحدة من الخرز الجاف واغسلها مرة واحدة باستخدام عازلة الفوسفات (قائمة المواد) ، وأعد تعليقها في 50 ميكرولتر من عازلة الفوسفات ، وخزنها في درجة حرارة 4 درجات مئوية. سيشار إلى تحضير الخرزة المركز هذا باسم "حبات MPTMS" في الخطوات التالية.
ملاحظه: مع التخزين المناسب ، يمكن أن تظل حبات MPTMS تعمل لمدة تصل إلى ثلاثة أشهر.
3. وظائف الخرزة
- بروتينات الطلاء التساهمي على الخرز
- خذ حجما معينا (على سبيل المثال ، 2.5 ميكرولتر) من مخزون البروتين واخلطه بحجم متساو من المخزن المؤقت للكربونات / البيكربونات لعمل المحلول 1.
ملاحظه: يعتمد الحجم على تركيز المخزون وكثافة الموقع النهائية المطلوبة للبروتين على سطح الخرز.
- في دورق صغير ، تزن 2-3 مجم من رابط MAL-PEG3500-NHS (قائمة المواد) وقم بإذابتها باستخدام محلول كربونات / بيكربونات للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 0.231 مجم / مل.
- امزج المحلول 1 بحجم متساو من محلول الرابط المحضر في 3.1.2. احتضن الخليط في RT لمدة 30 دقيقة لعمل المحلول 2.
- في هذه الأثناء ، ضع زجاجة الرابط بغطاء مفكك في مجفف زجاجي مملوء بالمجففات في الأسفل ومكنسة كهربائية لمدة 5 دقائق ، واملأ المجفف بالأرجون. شد الغطاء وأخرج الزجاجة. أغلق الزجاجة بغشاء بارافين بلاستيكي ، وضعها في وعاء مملوء بالمجففات في الأسفل ، واحفظها في درجة حرارة -20 درجة مئوية
ملاحظه: يجب إنجاز الخطوات التي تنطوي على استخدام رابط MAL-PEG3500-NHS ، بما في ذلك 3.1.2-3.1.4 (باستثناء الحضانة في 3.1.3) ، في أسرع وقت ممكن.
- امزج 5 ميكرولتر من حبات MPTMS مع المحلول 2 وأضف عازلة الفوسفات (قائمة المواد) لعمل حجم نهائي يبلغ 250 ميكرولتر.
- احتضان الخرزات طوال الليل في RT ، واغسلها 3 مرات باستخدام عازلة الفوسفات ، وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من عازلة الفوسفات ، وخزنها في 4 درجات مئوية.
- تحضير الخرز المطلي بالبروتين / الستربتافيدين (SA)
- اتبع البروتوكول 3.1.1-3.1.4.
- امزج 5 ميكرولتر من حبات MPTMS مع المحلول 2 و 5 ميكرولتر من محلول 4 مجم / مل Streptavidin-Maleimide (SA-MAL) (قائمة المواد) ثم أضف عازلة الفوسفات لعمل حجم نهائي قدره 250 ميكرولتر.
- احتضان الخرزات طوال الليل في RT ، واغسلها 3 مرات باستخدام عازلة الفوسفات ، وأخيرا أعد تعليقها في 100 ميكرولتر من عازلة الفوسفات وتخزينها عند 4 درجات مئوية.
- طلاء ستربتافيدين على الخرز الزجاجي
- امزج 5 ميكرولتر من حبات MPTMS مع 5 ميكرولتر من محلول SA 4 مجم / مل وأضف 140 ميكرولتر من محلول الفوسفات.
- احتضان الخرزات طوال الليل في RT ، واغسلها 3 مرات باستخدام عازلة الفوسفات ، وأعد تعليقها في 50 ميكرولتر من محلول الفوسفات ، وخزنها في 4 درجات مئوية.
- طلاء الخرز المطلي بالبروتين الحيوي
- امزج 5 ميكرولتر من الخرز المطلي ب SA مع البروتين (الحجم حسب كثافة الطلاء المطلوبة) وأضف عازلة الفوسفات لجعل الحجم النهائي 100 ميكرولتر.
- يحتضن الخليط طوال الليل عند 4 درجات مئوية أو لمدة 3 ساعات عند RT ، ويغسل 3 مرات بمحلول الفوسفات ، ويعاد تعليقه في 50 ميكرولتر من الفوسفات ويخزن في 4 درجات مئوية.
< p class = "jove_title" >
4. تحضير الخلية
ملاحظة: لتنقية الخلايا ، اتبع بروتوكولات تنقية الخلايا القياسية المقابلة لنوع الخلايا المستخدمة ، على سبيل المثال ، الخلايا التائية أو خطوط خلايا معينة.
- بالنسبة لتجارب fBFP ، بمجرد تحضير تعليق الخلية ، أضف Fura2-AM (قائمة المواد) المذابة في DMSO في معلق الخلية للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ 2 ميكرومتر ، واحتضانه لمدة 30 دقيقة في RT ، ثم اغسله مرة واحدة. احتفظ بتعليق الخلية المحمل بالفلورسنت في الظلام حتى الاستخدام.
< p class = "jove_title" >
5. التحضير للماصات الدقيقة وغرفة الخلية
- تحضير الماصات الدقيقة
- قم بقص الأنابيب الزجاجية الشعرية الطويلة (قائمة المواد) باستخدام قاطع زجاجي إلى قطع قصيرة يبلغ طولها حوالي 3 بوصات. قم بتركيب قطعة واحدة على مجتذب الماصات الدقيقة (قائمة المواد) ، وانقر فوق الزر "سحب" بحيث يتم تسخين منتصف الشعيرات الدموية بواسطة الماكينة وسيتم سحب الشعيرات الدموية على الطرفين لعمل شعيرات دموية بأطراف حادة (ماصات دقيقة خام).
ملاحظه: باتباع إرشادات المنتج، يكون للتشكل المطلوب للماصة الخام مستدق 6-8 مم وطرف 0.1-0.5 ميكرومتر.
- قم بتركيب ماصة خام على حامل الماصة لحدادة الماصة الدقيقة (قائمة المواد). تسخين لإذابة الكرة الزجاجية على الحدادة. أدخل طرف الماصة الخام داخل الكرة الزجاجية. قم بتبريد الكرة الزجاجية واسحب الماصة الخام لكسرها من الخارج وترك طرفها داخل الكرة. كرر هذا الإجراء حتى يتم الحصول على فتحة الطرف المطلوبة.
ملاحظه: أمثلة على القطر الداخلي لطرف الماصة الدقيقة: 2.0-2.4 ميكرومتر لكرات الدم الحمراء ، ~ 1.5 ميكرومتر للحبة ، ~ 2-4 ميكرومتر للخلية التائية ، و -7 ميكرومتر لخلية الورم الهجين.
- بناء غرفة خلية
ملاحظة: تم بناء حجرة الخلية على أساس حامل غرفة محلي الصنع ، والذي يتكون من قطعتين من المربعات المعدنية (النحاس / الألومنيوم) ومقبض يربطهما ببعضهما البعض (الشكل 1 د).
- قم بقص غطاء 40 مم × 22 مم × 0.2 مم باستخدام قاطع زجاجي إلى قطعتين مقاس 40 مم × 11 مم × 0.2 مم (الغطاء 1 و 2). غطاء الغراء 1 عن طريق الشحوم على الجانب العلوي من حامل الغرفة بالطريقة التي يربط بها المربعين المعدنيين ، وبالمثل غطاء الغراء 2 إلى الجانب السفلي ، والذي سيشكل غرفة خلية متوازية (الشكل 1 د).
- استخدم ماصة لحقن 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت التجريبي بين الغطاء. تأكد من توصيل المخزن المؤقت بكلا الغطاء. قم بتدوير الغرفة ورجها برفق للسماح للمخزن المؤقت بلمس طرفي الغرفة.
- قم بحقن الزيت المعدني بعناية في جانبي الغرفة المحيطة بالمنطقة العازلة التجريبية وبالتالي إغلاق المخزن المؤقت من الهواء الطلق. قم بحقن معلقات حبات المسبار (على سبيل المثال ، الخرز المطلي ب pMHC) ، وكرات الدم الحمراء ، والأهداف (على سبيل المثال ، الخلايا التائية) في المناطق العلوية والوسطى والسفلية من المنطقة العازلة على التوالي.
< p class = "jove_title" >
4. تجربة BFP
- قم بتشغيل المجهر (قائمة المواد) ومصدر الضوء. ضع الغرفة على مرحلة المجهر الرئيسي (الشكل 1 أ ، د).
- قم بتركيب جميع الماصات الدقيقة الثلاثة ل BFP (الشكل 1D). اليسار: مسبار ، للاستيلاء على كرات الدم الحمراء ، اليمين: الهدف ، للاستيلاء على خلية أو حبة ، أسفل اليمين: مساعد ، للاستيلاء على حبة).
- استخدم حاقن دقيق (قائمة المواد) لردم ماصة دقيقة بمخزن مؤقت تجريبي. انزع حامل الماصة (قائمة المواد) واحتفظ به في مكان منخفض للسماح للماء بالتنقيط من الطرف. أدخل الماصة الدقيقة بسرعة في طرف الحامل وتأكد من عدم دخول فقاعة الهواء إلى الماصة الدقيقة أثناء الإدخال. شد المسمار الحامل.
- قم بتركيب كل حامل ماصة على المعالج الدقيق المقابل له. ادفع الماصة الدقيقة نحو الغرفة بحيث تدخل أطرافها إلى منطقة الغرفة العازلة. اضبط موضع الماصة الدقيقة واعثر عليها تحت مجال الرؤية المجهري.
- تحرك حول مرحلة حامل الغرفة للعثور على مستعمرات ثلاثة عناصر (كرات الدم الحمراء والأهداف وخرز المسبار) واحدة تلو الأخرى. اضبط موضع الماصة الدقيقة المقابلة عن طريق تدوير مقابض المعالجات للسماح لطرف الماصة الدقيقة بالاقتراب من خلية/حبة واحدة. قم بشفط الخلية/الخرزة عن طريق ضبط الضغط داخل الماصة الدقيقة المقابلة. ستلتقط جميع الماصات الدقيقة الثلاثة العناصر المقابلة لها.
- تحرك حول مرحلة حامل الغرفة للعثور على مساحة مفتوحة بعيدا عن مستعمرات العناصر المحقونة حيث سيتم إجراء التجربة. قم بتبديل الوضع المرئي للمجهر لتصور الصورة على برنامج الكمبيوتر على شاشة الكمبيوتر. انقل العناصر الثلاثة الموجودة على أطراف الماصة إلى مجال رؤية البرنامج.
- قم بمحاذاة حبة المسبار و RBC ، وقم بمناورة حبة المسبار بعناية إلى قمة كرات الدم الحمراء ، واصطدم الخرزة لفترة وجيزة بكرات الدم الحمراء وتراجع برفق. اضبط ضغط الماصة الدقيقة المساعدة لتفجير الخرزة برفق بعيدا ، بحيث تترك ملتصقة على قمة كرات الدم الحمراء (الشكل 1F). حرك الماصة الدقيقة المساعدة وقم بمحاذاة الهدف وحبة المسبار (الشكل 2 أ).
- في البرنامج ، في نافذة مجال الرؤية ، استخدم الأدوات الموجودة في البرنامج لقياس أنصاف أقطار الماصة الدقيقة للمسبار (Rp) ، و RBC (R0) ، ومنطقة التلامس الدائرية بين RBC وحبة المسبار (Rc) ، والتي تسمح بتقدير ثابت الزنبرك ل RBC (k) من خلال المعادلة التالية ، حيث Δp هو ضغط الشفط عند طرف ماصة المسبار. ملاحظة: يترتب على قانون هوك أن قوة الربط ، F ، يمكن قياسها كميا من خلال ناتج ثابت الزنبرك وإزاحة حبة المسبار (د) ، أي F = d (الشكل 2C).
- أدخل ثابت زنبرك كرات الدم الحمراء المطلوب في البرنامج (يرجى الرجوع إلى قسم البروتوكول 4.6. عادة ما يتم ضبط ثابت الزنبرك عند 0.25 أو 0.3 pN/nm لمقايسة مشبك القوة ومقايسة تردد الالتصاق و 0.1 pN/nm لمقايسة التذبذب الحراري) ، والتي ستعيد ضغط الشفط المطلوب في وحدة سنتيمتر واحد من الماء. اضبط ارتفاع خزان المياه الذي يتصل بماصة المسبار حتى يتم الوصول إلى ضغط الشفط المطلوب.
- ارسم خطا أفقيا عبر قمة كرات الدم الحمراء ، مما سينتج عنه منحنى في النافذة المجاورة يشير إلى السطوع (قيمة التدرج الرمادي) لكل بكسل على طول هذا الخط. اسحب خط العتبة ليكون عند نصف عمق المنحنى تقريبا (الشكل 2 أ ، ب).
ملاحظه: تشير النقطة الدنيا على منحنى السطوع أسفل خط العتبة إلى موضع حدود الخرزة ، وبالتالي يسمح بحد أدنى محلي واحد فقط. إذا كان هناك اثنان أو أكثر من الحدود الدنيا المحلية في الوقت الحالي ، فهذا يشير إلى أن الصورة ليست مثالية (على الأرجح بسبب خروج الصورة عن التركيز ، أو المحاذاة الضعيفة بين حبة المسبار وكرات الدم الحمراء).
- حدد وضع التجربة المطلوب: مقايسة التذبذب الحراري ، أو مقايسة تردد الالتصاق ، أو مقايسة مشبك القوة. اضبط المعلمات حسب الرغبة (على سبيل المثال ، قوة الاصطدام = 15 pN ، معدل التحميل = 1,000 pN / s ، وقت التلامس = 1 ثانية ، قوة التثبيت = 20 pN (لمقايسة مشبك القوة) ، إلخ).
- انقر فوق "ابدأ" ، والذي يسمح للبرنامج بتحريك الماصة المستهدفة ودفع الهدف داخل وخارج الاتصال بالمسبار (انظر قسم النتائج التمثيلية للحصول على التفاصيل). سيتم جمع البيانات بالتوازي ، والذي يسجل موضع حبة المسبار في الوقت الفعلي. أوقف البرنامج بالنقر فوق الزر "إيقاف التجربة" ، وفي ذلك الوقت ستظهر نافذة للسماح بحفظ البيانات المكتسبة.
