اختبار ملزم للمنافسة لدراسة شركاء البروتين المتنافسين المرتبطين ب GTPase

الملخص

المصدر: Williamson، R.C.، et al. مقارنة تقارب البروتينات المرتبطة ب GTPase باستخدام فحوصات المنافسة. J. Vis. Exp. (2015)

يوضح هذا الفيديو مقايسة منافسة لدراسة شركاء البروتين المرتبط ب GTPase. باستخدام بروتين GTPase المرتبط بالنيوكليوتيدات الثابت على الخرز المغناطيسي ، يمكن دراسة الارتباط التنافسي بين شريكين بروتيني متفاعلين لنفس موقع الارتباط على GTPase لتقييم صلات الارتباط لشركاء البروتين.

البروتوكول

1. تنقية GTPase الموسومة بضريبة السلع

والخدمات

1. استزراع بكتريا قولونية سلالة مثل BL21 تحولت مع pGEX-Rac1 O / N عند 37 درجة مئوية ، تهتز عند 220 دورة في الدقيقة ، في 500 مل من وسائط الحث الذاتي (25 ملي مولار Na₂HPO₄ ، 25 ملي مولار KH₂PO₄ ، 50 ملي NH₄Cl ، 5 ملي Na₂SO₄ ، 2 ملي مولار MgSO₄ ، 2 ملي مولار كلوريد_{الكالسيوم 2} ، 0.5٪ جلسرين ، 0.05٪ جلوكوز ، 0.2٪ لاكتوز ، 5 جرام تريبتون ، 2.5 جرام مستخلص الخميرة ، 100 ميكروغرام / مل أمبيسلين).
2. حصاد البكتيريا عن طريق الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 10,000 × جم ، 4 درجات مئوية.
3. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في كاشف استخراج البروتين سعة 20 مل ، ومثبط إنزيم البروتياز 1x ، واحتضانه لمدة 20 دقيقة في RT مع الانعكاس.
4. قم بتوضيح المحلل عن طريق الطرد المركزي عند 40,000 × جم لمدة 30 دقيقة.
5. أضف 2 مل من حبات الجلوتاثيون المغناطيسية ، مغسولة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS: 10 ملي Na₂HPO₄ ، 1.8 ملي مولار KH₂PO₄ ، 137 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.7 ملي كلوريد الكنوتر).
6. احتضان لمدة ساعتين ، وخلط عن طريق الانعكاس عند 4 درجات مئوية.
7. اغسل الخرزات المحملة بالبروتين أربع مرات باستخدام 10 مل PBS ، باستخدام فارز الجسيمات المغناطيسية لترسيب الخرزات في كل خطوة.
8. أعد تعليق الخرزات المحملة بالبروتين في 2 مل PBS وخزنها عند -80 درجة مئوية في 100 ميكرولتر لحين الحاجة.

فئة

2. التعبير عن البروتينات المرتبطة ب GTPase

1. في اليوم السابق للتجربة ، قامت البلازميدات الانتقالية بتشفير الإصدارات الموسومة بالبروتين الفلوري الأخضر (GFP) لكل بروتين مرتبط ب GTPase في قارورة منفصلة مقاس 75 سم² من HEK293T على النحو التالي. للتحقق من صحة تحميل النيوكليوتيدات ، قم بتحويل TrioD1 الموسوم ب GFP في قارورة ثالثة مقاس 75 سم² من HEK293T.
   1. تمييع بولي إيثيل أمين إلى 1 مجم / مل في 100 ميكرولتر معقم 150 ملي كلوريد الصوديوم.
   2. أضف 27 ميكرولتر من بولي إيثيل أمين المخفف إلى 223 ميكرولتر من وسط المصل المخفض.
   3. أضف 12 ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد إلى 250 ميكرولتر من وسائط المصل المختزلة.
   4. احتضان كل أنبوب لمدة 2 دقيقة في RT.
   5. امزج مزيج البولي إيثيل أمين والحمض النووي في أنبوب واحد ودوامة لمدة دقيقتين.
   6. احتضن لمدة 15-20 دقيقة في RT.
   7. استبدل وسط النمو (Dulbecco's Modified Eagle Media ، مصل بقري الجنين 10٪ ، 2 ملي لتر جلوتامين ، بدون مضادات حيوية) على 90٪ HEK293T ملتقى بوسائط نمو طازجة سعة 5 مل.
   8. أضف مزيج البولي إيثيل أمين / الحمض النووي المدمج إلى القارورة واحتضان O / N عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.

فئة

3. تنقية البروتينات المرتبطة ب GTPase

1. اشطف قوارير الخلايا المنقولة في PBS واستنزف القارورة لمدة 5 دقائق ، مع شفط السائل الحر.
2. اكشط الخلايا في محلول تحلل 500 ميكرولتر (50 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.8) ، 1٪ Nonidet P-40 ، 1x مثبط للبروتياز) في أنبوب ميكروفيوج.
3. الخلايا عن طريق الخلط عن طريق الانعكاس عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
4. أثناء التحلل ، اغسل مجموعتين من حبات GFP-Trap سعة 40 ميكرولتر ثلاث مرات باستخدام محلول تحلل جديد ، وترسيب الخرزات عند 2,700 × جم لمدة دقيقتين بين الغسيل.
5. قم بتوضيح المحللات عن طريق الطرد المركزي عند 21,000 × جم لمدة 10 دقائق.
6. انقل المحللة المصفاة لكل بروتين من البروتينات المنافسة لفصل حبات مصيدة GFP المغسولة والسماح لبروتينات GFP-fusion بالارتباط لمدة ساعتين ، وخلطها عن طريق الانعكاس عند 4 درجات مئوية.
7. اغسل حبات GFP-Trap المحملة مرتين في 50 ملي Tris-HCl (درجة الحموضة 7.8) ، 50 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.7٪ (وزن / حجم) Nonidet P-40 ومرتين في 50 ملي Tris-HCl (درجة الحموضة 7.6) ، 20 ملي مولار MgCl₂ ، ترسيب الخرز عند 2,700 × جم لمدة دقيقتين بين الغسل.
قم
8. بإزالة بروتينات اندماج GFP عن طريق إضافة 40 ميكرولتر 0.2 M جلايسين (درجة الحموضة 2.5) وسحب العينات لأعلى ولأسفل لمدة 30 ثانية. افعل ذلك بسرعة للحد من تلف البروتين المنقى.
9. قم بتحليل 1 ميكرولتر من كل بروتين منقى بواسطة اللطخة الغربية والمسبار باستخدام جسم مضاد مضاد ل GFP لتحديد عائد نسبي باستخدام نظام نشاف كمي وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. بدلا من ذلك ، حدد تركيزات البروتين عن طريق فحص حمض البيسنكونينيك (BCA) ولكن هذا يؤدي إلى حدوث أخطاء إذا لم تتفاعل البروتينات مع الفحص بطريقة متطابقة أو إذا كانت هناك بروتينات ملوثة.
10. معادلة تركيز البروتين المولي بإضافة 50 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.6) و 20 ملي مولار MgCl₂.

< p class = "jove_title" >4. تحميل النوكليوتيدات ل GTPase

1. قم بإذابة كمية واحدة من الخرز المغناطيسي GST-Rac1 ، المحضرة في الخطوة 1.
2. خذ 90 ميكرولتر من حبات GST-Rac1 واغسلها ثلاث مرات باستخدام 20 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.6) ، و 25 ملي كلوريد الصوديوم ، و 0.1 ملي مولار DTT ، و 4 ملي EDTA ، باستخدام فارز الجسيمات المغناطيسية لترسيب الخرزات في كل خطوة.
3. قم بالشفط من الخرز وأضف 100 ميكرولتر 20 ملي Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.6) و 25 ملي كلوريد الصوديوم و 0.1 ملي مولار DTT و 4 ملي EDTA.
4. وفقا لما إذا كان الناتج المحلي الإجمالي أو GTP أو عدم تحميل النيوكليوتيدات مطلوبا لتجربة المنافسة ، أضف 12 ميكرولتر 100 ملي مولار من الناتج المحلي الإجمالي ، أو 12 ميكرولتر 10 ملي مولار من جوانوزين 5 '- [γ-ثيو] ثلاثي الفوسفات (GTPγS) أو بدون نيوكليوتيدات إلى 60 ميكرولتر من حبات GST-Rac1.
5. بالنسبة لعناصر التحكم في تحميل النيوكليوتيدات ، قم بتقسيم الخرزات المتبقية إلى ثلاثة حصص سعة 10 ميكرولتر وأضف 2 ميكرولتر 100 ملي من الناتج المحلي الإجمالي ، أو 2 ميكرولتر 10 ملي مولار GTPγS أو بدون نيوكليوتيدات إلى كل أنبوب.
6. احتضان خلطات الخرز لمدة 30 دقيقة عند 30 درجة مئوية مع التحريض.
7. قم بتثبيت Rac1 المرتبط بالنيوكليوتيدات عن طريق إضافة 1 M MgCl₂: 3 ميكرولتر إلى المزيج التجريبي (الخطوة 4.4) ، و 0.5 ميكرولتر لكل مزيج من خلطات التحكم (الخطوة 4.5).

< p class = "jove_title" >5. المنافسة ملزمة

1. قم بإعداد 6 أنابيب ميكروفوج، يحتوي كل منها على:
   200 ميكرولتر 50 ملي Tris-HCl (درجة الحموضة 7.6) ، 20 ملي MgCl₂
   10 ميكرولتر حبات Rac1 التجريبية المحملة بالنيوكليوتيدات (من الخطوة 4.7)
   5 ميكرولتر بروتين مرتبط ب Rac1 A (بروتين ربط مستمر)
2. أضف إلى كل أنبوب 0 أو 1 أو 2.5 أو 5 أو 10 أو 20 ميكرولتر من بروتين Rac1 المرتبط B (بروتين ربط متغير). تفترض هذه الأحجام تركيزات مخزون متساوية تقريبا لبروتينات الربط الثابتة والمتغيرة وقد تحتاج إلى تعديل.
   1. اضبط أحجام البروتينات الملزمة A و B إذا كانت هناك اختلافات كبيرة في صلات الارتباط للبروتينين ويجب تحديد ذلك تجريبيا من خلال التكرارات التجريبية. اصنع الحجم الإجمالي لخليط الربط إلى 235 ميكرولتر بإضافة 50 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7.6) ، و 20 ملي مولار MgCl₂.
3. قم بإعداد أنبوب ميكروفوجي يحتوي على:
   200 ميكرولتر 50 ملي Tris-HCl (درجة الحموضة 7.6) ، 20 ملي MgCl₂
   10 ميكرولتر حبات Rac1 التجريبية المحملة بالنيوكليوتيدات (من الخطوة 4.7)
   10 ميكرولتر بروتين مرتبط ب Rac1 A (بروتين ربط ثابت)
4. قم بإعداد الناتج المحلي الإجمالي ، GTPγS ، وعدم وجود أنابيب تحكم في النيوكليوتيدات:
   200 ميكرولتر 50 ملي Tris-HCl (درجة الحموضة 7.6) ، 20 ملي MgCl₂
   10 ميكرولتر للتحكم في حبات Rac1 محملة في الخطوة 4.5 مع الناتج المحلي الإجمالي أو GTPγS أو بدون نيوكليوتيدات واستقرت في الخطوة 4.7.
   180 ميكرولتر HEK293T محللة GFP-TrioD1 ، محضرة كما في الخطوة 3.6
   4 ميكرولتر 1 م ملجمكلوريد₂
5. احتضان الخليط لمدة ساعتين ، واخلطه عن طريق الانعكاس عند 4 درجات مئوية.
6. اغسل الخرزات ثلاث مرات باستخدام 50 ملي مولار Tris-HCl (درجة الحموضة 7.6) و 20 ملي MgCl₂.
7. البروتينات المرتبطة ب Elute في 20 ميكرولتر مختزلة للعينة (50 ملي مولار Tris-HCl (الرقم الهيدروجيني 7) ، 5٪ SDS ، 20٪ جلسرين ، 0.02 مجم / مل بروموفينول أزرق ، 5٪ β-ميركابتو إيثانول).

المواد