$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. إنتاج المصفوفات الدقيقة لمستضد الأنفلونزا
- طباعة المستضدات على شرائح المصفوفات الدقيقة
- أعد تكوين كل مستضد مجفف بالتجميد بتركيز 0.1 مجم / مل في محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مع 0.001٪ توين -20 (T-PBS). نقل 10 ميكرولتر من كل مستضد معاد تكوينه إلى آبار فردية من صفيحة مسطحة القاع غير المعالجة 384 بئرا.
- اطبع المستضدات باستخدام طابعة مصفوفة دقيقة مزودة بدبابيس اكتشاف مصفوفة دقيقة منخفضة الحجم تشفق المستضد في قناة العينة وتودعها عن طريق التلامس المباشر والحركة الشعرية على شرائح زجاجية مطلية بالنيتروسليلوز مكونة من 16 وسادة.
- قم ببرمجة برنامج الطباعة (على سبيل المثال ، Gridder) باستخدام تكوين لوحة المصدر ومعلمات الطباعة.
- استخدم القائمة المنسدلة لتحديد اسم نوع اللوحة الذي سيتم استخدامه مع طريقة الطباعة هذه. في هذه الدراسة ، استخدم صفيحة مسطحة القاع 384 بئرا غير معالجة.
- حدد مربع النص الموجود بجوار عدد اللوحات واكتب عدد لوحات العينة التي سيتم استخدامها في بروتوكول الطباعة هذا. لهذه الدراسة ، استخدم 1 لوحة.
- حدد تكوين دبوس لاستخدامه مع هذه الطريقة. في هذه الدراسة، استخدم تكوينا من 8 سنون.
- تأكد من أن إزاحات الأصل هي المسافات (في الاتجاهين X وY) بين أصل الشريحة (التي تمت معايرتها في القسم الإداري) والموقع الذي ستبدأ فيه دبابيس الطباعة على الشرائح.
- باستخدام علامة التبويب تصميم الصفيف، حدد حجم المصفوفات وشكلها (تباعد النقاط وعدد النقاط لكل صفيف فرعي). في هذه الدراسة ، قم بطباعة 324 نقطة (قطر 180 ميكرومتر مع تباعد 300 ميكرومتر) على شرائح مكونة من 16 لوحة بتنسيق 18 × 18 باستخدام 8 دبابيس.
- حدد المعلمات الخاصة بكيفية التقاط دبابيس الطباعة للعينات وتوزيعها. في هذه الدراسة ، يستنشق كل دبوس 250 نانولتر من محلول المستضد ويطبع 1 نانولتر على كل نقطة من 40 نقطة (إجمالي 20 شريحة لجميع المسامير الثمانية)
- قم بتكوين بروتوكول تنظيف الدبوس وبروتوكول النشاف. في هذه الدراسة ، يتم غمس كل دبوس يطبع المستضد في ddH2O معقم في حاوية غسيل صوتنة ثم يستنشق المستضد التالي.
- حدد التسلسل الذي تتم فيه طباعة كتل العينة على الشرائح. سيقوم برنامج المصفوفة بإنشاء ملف فهرس شبكي مشروح (.gal) لوصف ترتيب المستضدات داخل كل مصفوفة دقيقة.
ملاحظه: يستخدم الصف العلوي للإيقاعات (مع التألق في جميع الأطوال الموجية المستخدمة في التصوير ، على سبيل المثال ، مزيج من Qdot 585 نانومتر ستربتافيدين مترافق و Qdot 800 نانومتر ستربتافيدين مترافق في هذه الدراسة) لتوجيه الشبكات أثناء التصوير. لعمليات الطباعة الطويلة، يمكن إعادة تعليق المستضدات الموجودة في لوحة المصدر بشكل دوري عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل ثم الطرد المركزي، أو يمكن تحضير لوحة مصدر جديدة واستخدامها.
- ضع شرائح المصفوفات الدقيقة غير المفرغة في صندوق مقاوم للضوء واحتفظ بها في خزانة مجففة في درجة حرارة الغرفة للتخزين طويل الأجل.
ملاحظه: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا إلى أجل غير مسمى في هذه المرحلة.
- إجراء فحص مراقبة الجودة (يتطلب علامات بولي هيستيدين)
- قم بتوصيل الشريحة بغرف الفحص وأعد الترطيب باستخدام مخزن مؤقت مانع كما هو موضح في الخطوات 2.1.1-2.1.2 والموضحة في الشكل 1.
- تمييع الفأر أحادي النسيلة بولي - له الجسم المضاد 1: 100 في فلتر 1x مانع المخزن المؤقت.
ملاحظه: إذا تم استخدام مستضدات البروتين غير المنقاة (على سبيل المثال ، معبرا عنها في نظام النسخ والترجمة في المختبر) مباشرة لطباعة المصفوفات الدقيقة ، أضف مكونات نظام تعبير البروتين (على سبيل المثال ، بكتريا قولونية) بنسبة 1:10 مع المخزن المؤقت المانع المستخدم لتخفيف المصل من أجل منع أي أجسام مضادة موجهة ضد هذه المكونات.
- أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد المخفف إلى كل غرفة منزلقة تحتوي على وسادة المصفوفة بعد الشفط واحتضانها لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر. اغسل 3 مرات باستخدام المخزن المؤقت T-TBS كما هو موضح في الخطوة 2.2.1. تمييع الجسم المضاد الثانوي IgG للماعز المترافق بالبيوتين 1: 200 في المخزن المؤقت المانع ، وإضافة 100 ميكرولتر لكل بئر بعد الشفط ، واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة على شاكر. اغسل 3 مرات باستخدام المخزن المؤقت T-TBS.
- تمييع Qdot 585 نانومتر ستربتافيدين مترافق إلى 4 نانومتر في المخزن المؤقت المانع ، وأضف 100 ميكرولتر لكل بئر بعد الشفط ، واحتضن لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة على شاكر. اغسل 3x باستخدام المخزن المؤقت T-TBS ، ثم مرة واحدة باستخدام المخزن المؤقت TBS (بدون Tween).
- تفكيك الشرائح وتحديدها كميا كما هو موضح في الخطوات 2.2.5 – 3.1.2.
ملاحظه: يجب أن تحتوي مستضدات البروتين على علامات His10 لاستخدام بروتوكول مراقبة الجودة هذا. بدلا من ذلك ، إذا تم تضمين علامة مختلفة ، فيمكن إجراء فحص مراقبة الجودة باستخدام جسم مضاد أو رابط لتلك العلامة.
< p class = "jove_title" >
2. فحص مصل الأجسام المضادة للأنفلونزا باستخدام المصفوفات الدقيقة
- احتضان الأمصال على المصفوفات الدقيقة لربط الأجسام المضادة.
- قم بإرفاق شرائح المصفوفات الدقيقة بالغرف باستخدام المشابك وضعها في إطارات كما هو موضح في الشكل 2.
ملاحظه: تجنب دائما لمس لوحة المصفوفة الدقيقة باليدين والأدوات. تأكد من توجيه الشرائح بحيث يكون جانب الوسادة لأعلى والشق الصغير في الزاوية اليمنى العليا.
- أعد ترطيب شرائح المصفوفة الدقيقة بسعة 100 ميكرولتر لكل بئر من المخزن المؤقت المانع 1x المفلتر ، وتخفيف المصل 1: 100 في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت المانع (يمكن استخدام ألواح 96 بئر غير معالجة أو أنابيب 2 مل). احتضان كل من شرائح المصفوفة الدقيقة المعاد ترطيبها في إطارات مغطاة والأمصال المخففة بشكل منفصل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري عند 100-250 دورة في الدقيقة. قم بتنفيذ جميع خطوات الحضانة اللاحقة بالمثل على شاكر.
ملاحظه: يجب أن تكون الأمصال مجمعة وتجميدها عند -80 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل لتقليل دورات التجميد والذوبان ويجب دوامها للخلط والطرد المركزي لإزالة الجسيمات قبل الاستخدام. راقب غرف الانزلاق بعناية أثناء هذه الخطوة وبعدها للكشف عن أي تسرب يتطلب إعادة تجميع غرف الانزلاق.
- باستخدام أطراف الماصة المتصلة بخط تفريغ مع قارورة تجميع ثانوية، قم بسحب المخزن المؤقت للحجب بعناية من زاوية كل حجرة دون لمس الوسادات. قم بتنفيذ جميع خطوات الشفط اللاحقة بالمثل. أضف السيرام المخففة إلى الفوط بسرعة بعد الشفط حتى لا تسمح للضمادات بالجفاف.
- ضع الإطارات المغطاة في صواني داخل وعاء ثانوي محاط بمناشف ورقية مبللة ومحكمة الغلق لمنع التبخر. احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية على شاكر هزاز (بدلا من ذلك ، يمكن أن يحتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري عند 100-250 دورة في الدقيقة).
- تسمية الأجسام المضادة المصلية المرتبطة بالأجسام المضادة الثانوية المترافقة مع النقاط الكمومية
- شفط الأمصال من الغرف بعناية كما هو موضح أعلاه ، أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من المخزن المؤقت T-TBS (20 ملي مولار Tris-HCl ، 150 ملي كلوريد الصوديوم ، 0.05٪ توين -20 في ddH2O معدلة إلى درجة الحموضة 7.5 وتصفية ، يمكن الحصول عليها تجاريا) ، واحتضانها لمدة 5 دقائق على شاكر مداري عند 100-250 دورة في الدقيقة. كرر خطوة الغسيل هذه بإجمالي 3 مرات (يتم تنفيذ جميع خطوات الغسيل اللاحقة بالمثل).
- تحضير خليط من الأجسام المضادة الثانوية المخففة إلى 1 ميكرومتر في المخزن المؤقت المانع واخلطها جيدا عن طريق سحب العينات قبل وأثناء الاستخدام للحفاظ على التجانس.
ملاحظه: للحفاظ على قابلية الاختبار ، يجب استخدام نفس الدفعة من كل جسم مضاد ثانوي لجميع تجارب التحقيق التي يتم التخطيط للمقارنة الكمية للبيانات عبر التجارب. قد يلزم تغيير التركيز المحدد للجسم المضاد الثانوي اعتمادا على التقارب. اتبع بروتوكولات الشركة المصنعة كلما كان ذلك متاحا.
- قم بشفط المخزن المؤقت من الغرف بعد الغسيل النهائي ، أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من خليط الأجسام المضادة الثانوية ، واحتضن لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على شاكر.
- شطب خليط الأجسام المضادة الثانوية يغسل 3 مرات باستخدام المخزن المؤقت T-TBS ، ثم يغسل مرة واحدة باستخدام TBS buffer (بدون Tween).
- قم بفك شرائح المصفوفات الدقيقة من الغرف بعناية لتجنب لمس الوسادات ، واشطفها برفق باستخدام ddH2O المصفى ، وجففها بوضعها في أنابيب سعة 50 مل والطرد المركزي عند 500 × جم لمدة 10 دقائق.
- ضع شرائح المصفوفات الدقيقة التي تم فحصها في صندوق مقاوم للضوء واحتفظ بها في خزانة مجففة في درجة حرارة الغرفة للتخزين طويل الأجل.
ملاحظه: قد يتم إيقاف البروتوكول مؤقتا لمدة تصل إلى أسبوع واحد في هذه المرحلة.
< p class = "jove_title" >
3. تحديد ارتباط الجسم المضاد بالمستضدات داخل المصفوفة الدقيقة
- تصور شرائح المصفوفات الدقيقة وتحديد كثافة التألق الموضعي لقياس ارتباط الأجسام المضادة.
- احصل على صور لشرائح المصفوفات الدقيقة باستخدام جهاز التصوير المحمول المزود ببرنامج مدمج.
- في علامة التبويب تكوين Imager، حدد تكوين الشريحة المناسب. في هذه الدراسة ، استخدم شرائح مكونة من 16 وسادة.
- في علامة التبويب التحكم في الصورة، حدد قناة الفلورسنت المناسبة، واضبط الكسب ووقت التعرض ووقت الاستحواذ اعتمادا على تفاعل المصل للحصول على الصور المثلى. بالنسبة لهذه الدراسة ، كانت قنوات الفلورسنت ل IgA و IgG 585 نانومتر و 800 نانومتر على التوالي ، وكانت إعدادات التصوير مكاسب 50 ، ووقت التعرض 500 مللي ثانية ، ووقت اكتساب 1 ثانية.
- انقر فوق Capture لبدء عملية الحصول على الصورة.
ملاحظه: يمكن إعادة تصوير شرائح المصفوفات الدقيقة في إعدادات متعددة دون تدهور الإشارات طالما أنها مخزنة مظلمة وجافة. يمكن استخدام أنظمة تصوير أخرى إذا كانت متوافقة مع الشرائح.
- اكتشف بقع المصفوفة باستخدام الشبكات الموجهة بناء على العلامات الإيمانية وقم بقياس شدة البقعة كمتوسط لشدة البكسل مطروحا منها الخلفية المقاسة حول البقع. قم بإجراء خوارزمية القياس الكمي هذه دفعة واحدة باستخدام برنامج التصوير المدمج ، والذي يستخدم ملف .gal الذي تم إنشاؤه في الخطوة 1.1.2 لتوصيل شدة البقع بالمستضدات الفردية في كل مصفوفة دقيقة.
- في لوحة معلومات الملف، قم بتحميل ملف .gal عن طريق التحديد من مجلده على الكمبيوتر، وحدد المجلد الذي سيتم حفظ ملفات إخراج التحليل فيه في قسم خيارات التحليل.
- في علامة التبويب "التحكم في الصورة"، افتح إحدى الصور المكتسبة ليتم قياسها وحدد الزر "تلقائي" في الزاوية اليمنى العليا.
- في قسم تحليل المصفوفة في الزاوية اليمنى السفلية ، قم بإنشاء قالب ائتماني وفقا لتعليمات البرنامج.
- انقر فوق تحليل الدفعات ، وحدد المجلد الذي يحتوي على الصور المراد تحديدها كميا ، وحدد القالب الإيماني الذي تم إنشاؤه في الخطوة السابقة. يحلل البرنامج كل صورة ويحدد كثافة البقعة.
ملاحظه: ستولد هذه الخطوة ملفا .csv يحتوي على شدة موضعية تحدد الأجسام المضادة داخل كل عينة مصل ترتبط بكل مستضد فردي على المصفوفة الدقيقة والتي يمكن التلاعب بها لاحقا في برنامج معالجة جداول البيانات أو التحليل.
- تحليل البيانات الأولية لمقارنة ارتباط الأجسام المضادة عبر المستضدات وعبر عينات المصل. في هذه الدراسة ، تمت مقارنة الأجسام المضادة IgA و IgG التي تم قياسها على أنها 585 نانومتر و 800 نانومتر من شدة البقع الفلورية عبر جميع المستضدات بين جولتين مستقلتين من التجربة باستخدام شرائح مختلفة في أيام مختلفة ، وتم إجراء تحليل الارتباط لقياس قابلية استنساخ الفحص.
ملاحظه: بالنسبة للبروتينات غير المنقاة المطبوعة كخليط تعبير ، يجب أن يبدأ تحليل البيانات بطرح الخلفية لعدم وجود تحكم في الحمض النووي.
