مقالة منهجية

الفحص المجهري TIRF لتصور ديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Henty-Ridilla، J.L.، تصور ديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في المختبر عن طريق الفحص المجهري لمضان الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF). J. Vis. Exp. (2022)

يصف هذا الفيديو TIRF ، وهي تقنية قائمة على الفحص المجهري الانعكاس الداخلي الكلي لتصور ديناميكيات بلمرة الأكتين والأنابيب الدقيقة. تسمح الطريقة بالتصوير عالي الدقة لديناميكيات اقتران الأكتين والأنابيب الدقيقة في الوقت الفعلي ، وهو أمر ضروري لفهم الحديث المتبادل الخلوي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_title" >1. غسل أغطية

ملاحظة: اغسل أغطية (24 مم × 60 مم ، # 1.5) وفقا ل Smith et al. ، 2013.

  1. رتب أغطية في حاوية بريد منزلق بلاستيكية.
  2. غمر أغطية بالتسلسل في المحاليل التالية والصوتنة لمدة 30-60 دقيقة ، والشطف مع ddH2O 10 مرات بين كل محلول: ddH2O مع قطرة واحدة من صابون الأطباق ؛ 0.1 M KOH. قم بتخزين أغطية الإيثانول بنسبة 100٪ لمدة تصل إلى 6 أشهر.
    ملاحظه: لا تلمس الأسطح الزجاجية بأصابع غير محبوبة. استخدم الملقط بدلا من ذلك.
فئة

2. طلاء نظيف (24 مم × 60 مم ، # 1.5) أغطية مع mPEG- و biotin-PEG-silane

ملاحظة: يستخدم هذا البروتوكول على وجه التحديد نظام البيوتين والستربتافيدين لوضع الأكتين والأنابيب الدقيقة داخل مستوى التصوير TIRF. يمكن استخدام الطلاءات والأنظمة الأخرى (على سبيل المثال ، الأجسام المضادة ، بولي إل ليسين ، ميوسين NEM ، إلخ).

  1. قم بإذابة كميات من مساحيق PEG-silane والبيوتين-PEG-silane.
  2. قم بإذابة مساحيق PEG في 80٪ من الإيثانول (درجة الحموضة 2.0) لتوليد محاليل مخزون طلاء من 10 مجم / مل mPEG-silane و 2-4 مجم / مل من البيوتين -PEG-silane ، قبل الاستخدام مباشرة.
    ملاحظه: غالبا ما تظهر مساحيق PEG مذابة ولكنها قد لا تكون على المستوى المجهري. تستغرق إعادة التعليق المناسبة ~ 1-2 دقيقة مع سحب العينات المستمر. يتم تشجيع المستخدمين على الماصة 10 مرات إضافية بعد ظهور ذوبان المسحوق.
    أنذر: ارتد قفازات لحماية البشرة من حمض الهيدروكلوريك المركز عند صنع 80٪ من الإيثانول (درجة الحموضة 2.0).
  3. قم بإزالة الغطاء النظيف (24 مم × 60 مم ، # 1.5) من تخزين الإيثانول باستخدام ملقط. يجفف بغاز النيتروجين ويخزن في طبق بتري نظيف.
  4. قم بتغطية الأغطية ب 100 ميكرولتر من محلول الطلاء: خليط من 2 مجم / مل mPEG-silane (MW 2,000) و 0.04 مجم / مل من البيوتين - PEG - silane (MW 3,400) في 80٪ إيثانول (درجة الحموضة 2.0).
    ملاحظه: للطلاء المتناثر (موصى به) استخدم 2 مجم / مل mPEG-silane و 0.04 مجم / مل من البيوتين - PEG - سيلان. للطلاء الكثيف ، استخدم 2 مجم / مل mPEG-silane ، 4 مجم / مل من البيوتين - PEG-silane.
  5. احتضان أغطية عند 70 درجة مئوية لمدة 18 ساعة على الأقل أو حتى الاستخدام.
    ملاحظه: تتحلل أغطية المغلفة إذا تم تخزينها عند 70 درجة مئوية لأكثر من أسبوعين.
< p class = "jove_title" >3. تجميع غرف تدفق التصوير
  1. قص 12 شريطا من الشريط اللاصق على الوجهين بطول 24 مم. قم بإزالة جانب واحد من دعامة الشريط وقم بتثبيت قطع الشريط المجاورة للأخاديد الستة الموجودة في غرفة تصوير نظيفة.
    ملاحظه: يجب أن يكون الشريط مسطحا للتجميع المناسب ، وإلا فسوف تتسرب غرف التصوير. قم بإزالة دعامة الشريط بعناية لتجنب الصدمات. يوصى بانزلاق الغرف المسجلة على سطح نظيف لتنعيم ملامسات غرفة الشريط.
  2. قم بإزالة القطعة الثانية من دعامة الشريط لكشف الجانب اللاصق من الشريط على طول كل أخدود في الغرفة. ضع شريط الحجرة لأعلى على سطح نظيف.
  3. امزج راتنجات الايبوكسي ومحاليل المقسى 1: 1 (أو وفقا لتعليمات الشركة المصنعة) في قارب وزن صغير.
  4. استخدم طرف P1000 لوضع قطرة من الإيبوكسي المختلط بين شرائط الشريط في نهاية كل أخدود لغرفة التصوير (سهم أحمر; الشكل 1 أ). ضع شريط الحجرة / جانب الإيبوكسي لأعلى على سطح نظيف.
  5. قم بإزالة غطاء مغلف من الحاضنة 70 درجة مئوية. اشطف الأسطح المطلية وغير المطلية من الغطاء باستخدام ddH2O ست مرات ، وجففها بغاز النيتروجين المصفى ، ثم ألصقها على غرفة التصوير مع جانب طلاء الغطاء باتجاه الشريط.
  6. استخدم طرف ماصة P200 أو P1000 للضغط على واجهة الشريط الزجاجي لضمان إحكام جيد بين الشريط وقلة الغطاء.
    ملاحظه: مع الختم المناسب ، يصبح الشريط على الوجهين شفافا. سوف تتسرب غرف التصوير التي تفتقر إلى ملامسات غرفة الشريط الكافية.
  7. احتضان الغرف المجمعة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق على الأقل للسماح للإيبوكسي بإغلاق آبار الغرفة بالكامل قبل الاستخدام. تنتهي صلاحية غرف التروية في غضون 12-18 ساعة من التجميع.
    ملاحظه: اعتمادا على موضع الشريط وسمك الشريط على الوجهين المستخدم ، سيكون للغرفة المجمعة حجم نهائي يتراوح بين 20 و 50 ميكرولتر.
< ص الفئة = "jove_title" >4. تكييف غرف التروية
  1. استخدم مضخة التروية (المعدل المحدد على 500 ميكرولتر / دقيقة) لتبادل محاليل التكييف بالتتابع في حجرة التروية على النحو التالي:
    1. تدفق 50 ميكرولتر من 1٪ BSA لتجهيز غرفة التصوير. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من خزان تركيب قفل Luer.
    2. تدفق 50 ميكرولتر من 0.005 مجم / مل ستربتافيدين. احتضن لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من الخزان.
    3. تدفق 50 ميكرولتر من 1٪ BSA لمنع الارتباط غير المحدد. احتضان لمدة 10-30 ثانية. قم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من الخزان.
    4. تدفق 50 ميكرولتر من المخزن المؤقت الدافئ (37 درجة مئوية) 1x TIRF (1x BRB80 ، 50 ملي KCl ، 10 ملي مولار DTT ، 40 ملي جلوكوز ، 0.25٪ (حجم / حجم) ميثيل السليلوز (4,000 cp)).
      ملاحظه: لا تقم بإزالة المخزن المؤقت الزائد من الخزان. هذا يمنع الغرفة من الجفاف ، مما قد يؤدي إلى إدخال فقاعات الهواء في النظام.
    5. اختياري: تدفق 50 ميكرولتر من بذور الأنابيب الدقيقة المستقرة و 50٪ المخففة في 1x TIRF buffer.
      ملاحظه: يجب تحديد التخفيف المناسب تجريبيا ويحتوي على تباين من دفعة إلى أخرى. يعمل التخفيف الذي ينتج عنه 10-30 بذرة لكل مجال رؤية بشكل جيد مع هذا الإعداد.
< p class = "jove_title" >5. تحضير المجهر

ملاحظة: يتم تصور / تنفيذ التفاعلات الكيميائية الحيوية التي تحتوي على خيوط الأكتين الديناميكية والأنابيب الدقيقة باستخدام مجهر مضان الانعكاس الداخلي الكلي المقلوب (TIRF) المجهز بليزر الحالة الصلبة 120-150 ميجاوات ، وهدف TIRF غمر الزيت المصحح بدرجة الحرارة 63x ، وكاميرا EMCCD. يتم تصور البروتينات في هذا المثال عند الأطوال الموجية التالية: 488 نانومتر (الأنابيب الدقيقة) و 647 نانومتر (الأكتين).

  1. اضبط جهاز سخان المسرح / الهدف للحفاظ على 35-37 درجة مئوية قبل 30 دقيقة على الأقل من تصوير التفاعل الكيميائي الحيوي الأول.
  2. قم بتعيين معلمات الحصول على الصور على النحو التالي:
    1. اضبط الفاصل الزمني للاكتساب على كل 5 ثوان لمدة 15-20 دقيقة.
    2. اضبط تعريضات الليزر 488 و 647 على 50-100 مللي ثانية بقوة 5٪ -10٪. اضبط زاوية TIRF المناسبة للمجهر.
      ملاحظه: بغض النظر عن إعداد المجهر ، فإن أبسط طريقة لضبط طاقة الليزر والتعرض وزاوية TIRF هي إجراء تعديلات على صور أي من البوليمرين وحده (انظر 5.2.2.1 و 5.2.2.2 أدناه). يتم تشجيع المستخدمين بشدة على استخدام أقل إعدادات طاقة الليزر والتعرض التي لا تزال تسمح بالاكتشاف.
      1. اضبط تفاعل البلمرة (الشكل 1C) لبدء تجميع خيوط الأكتين والحصول على الصور عند 647 نانومتر. قم بإجراء التعديلات المناسبة.
      2. اضبط تفاعل البلمرة في بئر نضح مكيف ثان لبدء تجميع الأنابيب الدقيقة (الشكل 1 ج) وتصوره عند 488 نانومتر. قم بإجراء التعديلات المناسبة.
< p class = "jove_title" >6. تحضير خلطات تفاعل البروتين
  1. قم بإعداد محلول مخزون من التوبولين المسمى بالفلورسنت.
    1. تحديد تركيز التوبولين محلي الصنع غير المسمى عن طريق القياس الطيفي في Abs280 ، على النحو التالي:
      1. مقياس الطيف الضوئي الفارغ مع 1xBRB80 يفتقر إلى GTP.
      2. احسب تركيز التوبولين باستخدام معامل الانقراض المحدد البالغ 115,000 م ‐ 1 سم ‐ 1 والصيغة التالية: < br / > figure-protocol-1
    2. قم بتعليق 488-توبولين المجفف بالتجميد تجاريا إلى 10 ميكرومتر (1 مجم / مل ؛ 100٪ ملصق ) مع 20 ميكرولتر من 1x BRB80 يفتقر إلى GTP.
    3. قم بإذابة 7.2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر من التوبولين المعاد تدويره غير المسمى على الثلج.
      ملاحظه: يعد التوبولين المعاد تدويره أمرا بالغ الأهمية لنجاح تجميع الأنابيب الدقيقة في المختبر لأنه يزيل الثنائيات غير المختصة بالبلمرة المتكونة في مخزونات البروتين المجمدة.
    4. امزج 3 ميكرولتر من 10 ميكرومتر 488-توبولين مع 7.2 ميكرولتر من 100 ميكرومتر توبولين غير مسمى ، لا يزيد عن 15 دقيقة قبل الاستخدام.
  2. تحضير محلول مخزون الأكتين المسمى بالفلورسنت.
    1. بالنسبة للبروتينات محلية الصنع ، حدد تركيز وتسمية النسبة المئوية للأكتين عن طريق قياس الطيف الضوئي AbsAbs290 و Abs650 ، على النحو التالي:
      1. مقياس الطيف الضوئي الفارغ مع G-buffer.
      2. احسب تركيز الأكتين غير المسمى باستخدام معامل الانقراض المحدد البالغ 25،974 م ‐ 1 سم ‐ 1 والصيغة التالية:
        figure-protocol-2
      3. احسب تركيز اللايسين المسمى Alexa-647-actin باستخدام معامل انقراض الأكتين غير المسمى ، وعامل تصحيح الفلور 0.03 ، والصيغة التالية:
        figure-protocol-3
      4. احسب تسمية النسبة المئوية ل Alexa-647-actin باستخدام ε المحدد ل Alexa-647 من 239,000 M-1 cm‐1 ، على النحو التالي:
        figure-protocol-4
    2. قم بإذابة 2 ميكرولتر من 3 ميكرومتر 100٪ من البيوتين أكتين المسمى (المسمى على بقايا اللايسين). خفف 10 أضعاف بإضافة 18 ميكرولتر من G-buffer.
    3. اجمع بين 3 ميكرولتر من الأكتين الحيوي المخفف ، والكميات المناسبة من الأكتين غير المسمى والملصق (أعلاه) بحيث يكون المزيج النهائي 12.5 ميكرومتر من إجمالي الأكتين مع 10٪ -30٪ ملصق الفلورسنت.
      ملاحظه: يمكن لأكثر من 30٪ من مونومرات الأكتين الفلورية (النهائية) أن تضر بدقة التصوير حيث يصعب تمييز الخيوط من الخلفية.
  3. تحضير خلطات التفاعل (الشكل 1 ج).
    1. تحضير مزيج الهيكل الخلوي (الأنبوب أ) عن طريق الجمع بين 2 ميكرولتر من مخزون مزيج الأكتين 12.5 ميكرومتر (6.2.3) مع مزيج مخزون التوبولين (6.1.4) ، قبل 15 دقيقة على الأكثر من التصوير. يحفظ على الثلج حتى الاستخدام.
    2. قم بإعداد مزيج تفاعل البروتين (الأنبوب B) من خلال الجمع بين جميع المكونات والبروتينات التجريبية الأخرى ، بما في ذلك 2x TIRF buffer ، ومضاد للتبييض ، والنيوكليوتيدات ، والمخازن المؤقتة ، والبروتينات الملحقة. يظهر مثال في الشكل 1C.
      ملاحظه: ينتج عن التخفيف النهائي 1x مخزن مؤقت TIRF يحتوي على ATP و GTP والقوة الأيونية ضمن النطاق الفسيولوجي المقدر.
  4. احتضان الأنبوب A والأنبوب B بشكل منفصل عند 37 درجة مئوية لمدة 30-60 ثانية. لبدء التفاعل ، امزج وأضف محتويات الأنبوب B إلى الأنبوب A (أدناه).

7. ديناميكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة للصورة

  1. حالة التروية جيدا (الشكل 1 ب ؛ الخطوة 4 أعلاه).
  2. ابدأ تجميع الأكتين والأنابيب الدقيقة في وقت واحد عن طريق إضافة محتويات الأنبوب B (مزيج التفاعل) إلى الأنبوب A (مزيج الهيكل الخلوي) (الشكل 1 ج).
  3. تدفق 50 ميكرولتر من التفاعل الذي يحتوي على 1x مخزن مؤقت TIRF مكمل ب 15 ميكرومتر من التوبولين الحر ، و 1 ملي مولار GTP ، و 0.5 ميكرومتر مونومرات أكتين وأحجام مناسبة من أدوات التحكم في العازلة.
  4. سجل أفلام الفاصل الزمني باستخدام برنامج المجهر للحصول عليها كل 5 ثوان لمدة 15-20 دقيقة
    ملاحظه: يحدث بدء ديناميكيات الأكتين والأنابيب الدقيقة في غضون 2-5 دقائق (الشكل 2). تشير التأخيرات الأطول إلى مشاكل في التحكم في درجة الحرارة أو مشاكل البروتينات المتعلقة بالتركيز في مزيج التفاعل.
  5. قم بتكييف بئر نضح جديد (الخطوة 4) واستبدل حجم المخزن المؤقت ببروتين (بروتينات) تنظيمية ذات أهمية (أي Tau) وعناصر التحكم في المخزن المؤقت (الشكل 1C). اكتساب كما هو موضح في الخطوة 7 (أعلاه) لتقييم البروتينات التنظيمية لوظائف الأكتين والأنابيب الدقيقة الناشئة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1. المخططات التجريبية: تجميع غرفة التدفق للحصول على الصورة. (أ) تجميع غرفة التصوير. من أعلى إلى أسفل: يتم تسجيل غرف التصوير IBIDI على طول آبار التروية (يشار إليها بالسهم) ؛ تتم إزالة الطبقة الثانية (البيضاء) من دعامة الشريط (المتبقية في الصورة الموضحة لتوجيه المستخدمين بشكل أفضل) ويتم تطبيق الإيبوكسي على حافة غرفة التروية (السهم). ملاحظة: لتوجيه المستخدمين بسهولة أكبر إلى مكان وضع الإيبوكسي ، تم ترك الدعامة الب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1٪ BSA (وزن / حجم) فيشر ساينتيك بي بي 1600-100 لهذا الغرض (حجب غرف TIRF) ، يتم تعليق BSA في ddH20 وتصفيته من خلال مرشح 0.22 ميكرومتر. 1× BRB80 محلي الصنع 80 ملي مولار ماصيل ، 1 ملي ملي MgCl2 ، 1 ملي مولار EGTA ، درجة الحموضة 6.8 مع KOH 80 ملي مولار ماصيل ، 1 ملي ملي MgCl2 ، 1 ملي مولار EGTA ، درجة الحموضة 6.8 مع KOH شركة سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري G2133-50KU يمزج مع الكاتلاز ، يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام 100 ميكرومتر توبولين شركة الهيكل الخلوي ، دنفر ، كولورادو تي 240 يجب إعادة تدوير التوبولين محلي الصنع قبل الاستخدام لإزالة التوبولين غير الكفء بالبلمرة (Hyman et al. (1992)29; لي ومور (2020) 30). غالبا ما تكون الأنابيب المتوفرة تجاريا مخففة جدا بحيث لا يمكن إعادة تدويرها ولكنها تعمل بشكل جيد إذا تم تعليقها وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وتم تنظيفها مسبقا عن طريق الطرد المركزي الفائق (278,000 × جم) لمدة 60 دقيقة ، قبل الاستخدام. 100 ملي متر ATP شركة Gold Biotechnology Inc ، أوليفيت ، ميزوري أ -08 معلق في ddH20 (درجة الحموضة 7.5) وتصفية معقمة. 100 ملي جي تي بي فيشر ساينتيك AC226250010 معلق في 1× BRB80 (درجة الحموضة 6.8) وتصفية معقمة. 120-150 ميجاوات ليزر الحالة الصلبة لايكا مايكروسيستمز 11889151؛ 11889148 2 مجم / مل كاتالاز شركة سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري سي 40-100 يمزج مع الجلوكوز أوكسيديز ، يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى الاستخدام 2× عازلة TIRF هومماد 2× BRB80 ، 100 ملي كلوريد كولينيوم ، 20 ملي DTT ، 80 ملي مولار جلوكوز ، 0.5٪ (حجم / حجم) ميثيل السليلوز (4,000 cp) ؛ ملاحظة: تمت إضافة 1 ميكرولتر من 0.1M GTP و 1 ميكرولتر من 0.1M ATP بشكل منفصل إلى تفاعلات TIRF لتجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة. 24 × 60 مم ، # 1.5 غطاء زجاجي فيشر ساينتفيك ، والثام ، ماساتشوستس 22-266882 يجب غسل الغطاء على نطاق واسع قبل الاستخدام (Smith et al. (2014) 22) 37 درجة مئوية كتلة حرارية حمام مائي 37 درجة مئوية 5 ملغ/مل ستربتافيدين (600 أضعاف المخزون) أفانتور ، فيلادلفيا ، بنسلفانيا RLS000-01 معلق في Tris-HCl (درجة الحموضة 8.8) ؛ تخفيف الكمية إلى 1× في المخزن المؤقت HEK في يوم الاستخدام 5 دقائق راتنجات الايبوكسي والمقسى لوكتايت ، روكي هيل ، كونيتيكت 1365736 قد يستغرق الراتنج المركب والمقسى ما يصل إلى 30 دقيقة للشفاء. 50٪ بذور الأنابيب الدقيقة GpCpp البيوتينيلية شركة الهيكل الخلوي. محلي الصنع تي 333 بي (اختياري) يمكن لبذور الأنابيب الدقيقة المستقرة GppCpp أو Taxol أن تتوسط بشكل أكثر كفاءة في بلمرة الأنابيب الدقيقة. يعمل Taxol و GppCpp على تثبيت الأنابيب الدقيقة بطرق مختلفة يمكن أن تؤثر على بنية شبكة الأنابيب الدقيقة وقدرة بعض البروتينات التنظيمية على الارتباط بالجزء المستقر من الأنابيب الدقيقة. تم توضيح طريقة لصنع أنواع متنوعة من بذور الأنابيب الدقيقة في Hyman et al. (1992). حاضنة 70 درجة مئوية مخزون مزيج الأكتين محلي الصنع؛ هذا البروتوكول مزيج أكتين 12.5 ميكرومتر يتكون من أكتين مصنف (فلوري وحيوي) وغير مصنف لما يصل إلى ستة تفاعلات. يتم استخدام 2 ميكرولتر من المخزون في تفاعل TIRF النهائي. التركيز النهائي للأكتين المستخدم في كل تفاعل هو 0.5 ميكرومتر (10٪ Alexa-647 ؛ 0.09٪ مسمى البيوتين). عناصر التحكم في المخزن المؤقت المناسبة محلي الصنع مجموعة من المخازن المؤقتة من جميع البروتينات التي يتم تقييمها البيوتين - PEG - سيلان (ميغاواط 3,400) شركة Laysan Bio Inc البيوتين-PEG-SIL-3400 يتم توزيعها على 2-5 مجم ، مملوءة بالنيتروجين ، ومغلقة ، وتخزينها في درجة حرارة -20 درجة مئوية مع المجفف حتى الاستخدام الأكتين البيوتينيل شركة الهيكل الخلوي. محلي الصنع أ ب 07 يتم تصنيع البيوتين أكتين عن طريق وضع العلامات على بقايا اللايسين ، وبالتالي يفترض أنه تم تصنيفه بنسبة 100٪ على الأقل ، ولكنه يختلف باختلاف الكميات / المستحضرات. يجب تحديد تركيزات الأكتين الحيوية المثلى تجريبيا لاستخدامات معينة / تصميمات تجريبية. تسمح التركيزات الأعلى بتتبع أكثر كفاءة ، ولكنها قد تعيق البلمرة أو التفاعلات مع البروتينات التنظيمية. هنا ، توجد نسبة صغيرة (0.09٪ أو 900 جزء من المليون) الأكتين البيوتينيل في تفاعل TIRF النهائي. صابون الأطباق داون ، بروكتر آند جامبل ، سينسيناتي ، أوهايو لأسباب غير معروفة ، ينظف الإصدار الأزرق أغطية بشكل أكثر كفاءة من الألوان الأخرى المتاحة. الثلج الجاف الأكتين المسمى بالفلورسنت شركة الهيكل الخلوي. محلي الصنع أر05 يتم تخزين الأكتين محلي الصنع المسمى بالفلورسنت في G-buffer مكمل بنسبة 50٪ من الجلسرين عند -20 درجة مئوية (Spudich et al. (1971) 47; ليو وآخرون (2022) 48). يتم تحليل الأكتين المصنف بالفلورسنت مقابل G-buffer ويتم إزالته مسبقا عن طريق الطرد المركزي الفائق لمدة 60 دقيقة عند 278,000 × جم قبل الاستخدام. توبولين مسمى بالفلورسنت شركة الهيكل الخلوي TL488M ، TLA590M ، TL670M يعاد تعليقه في 20 ميكرولتر 1× BRB80 (تركيز نهائي 10 ميكرومتر) ويتم تنظيفه مسبقا عن طريق الطرد المركزي الفائق (278,000 × جم) لمدة 60 دقيقة ، قبل الاستخدام. جي عازلة محلي الصنع 3 ملي تريس-حمض الهيدروكلوريك (درجة الحموضة 8.0) ، 0.2 ملي CaCl2 ، 0.5 ملي DTT ، 0.2 ملي ATP عازلة HEK محلي الصنع 20 ملي مولار HEPES (درجة الحموضة 7.5) ، 1 ملي EDTA (درجة الحموضة 8.0) ، 50 ملي كلوريد جليد دلو الثلج غرفة التصوير IBIDI ، فيتشبرج ، ويسكونسن 80666 اطلب غرف بدون قاع لاستخدام طلاءات غطاء مختلفة كاميرا iXon Life 897 EMCCD أندور ، بلفاست ، أيرلندا الشمالية 8114137 برنامج المجهر LASX Premium لايكا مايكروسيستمز 8114137 ميثيل السليلوز (4,000 cp) شركة سيجما ألدريتش م 0512 قاعدة مجهرية مجهزة بوحدة TIRF لايكا مايكروسيستمز ، ويتزلار ، ألمانيا 11889146 mPEG-silane (ميغاواط 2,000)

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة