مقالة منهجية

الفحص المجهري للورقة الضوئية الشبكية لتصور تفاعلات المستقبلات والترابط في الخلايا الحية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Rosenberg، J.، et al. تصور ديناميكيات مستقبلات الخلايا التائية السطحية رباعية الأبعاد باستخدام الفحص المجهري للورقة الخفيفة الشبكية. J. Vis. Exp. (2020).

في هذا الفيديو ، نصف تقنية الفحص المجهري للصفائح الضوئية الشبكية لتصور التفاعلات بين الخلايا التائية الحية والخلايا العارضة للمستضد. تتضمن الطريقة تركيز ورقة ضوئية شبكية رفيعة للغاية على زوج خلية متفاعلة للحصول على سلسلة من الصور ثنائية الأبعاد ، والتي يتم دمجها للحصول على صور رباعية الأبعاد عالية الدقة تكشف عن الديناميكيات الزمانية المكانية للتفاعل بين الخلية والخلية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة < ص = "jove_title" >1. إجراء محاذاة LLSM اليومية

ملاحظة: (هام) يعتمد بروتوكول المحاذاة هذا على أداة LLSM المستخدمة (انظر جدول المواد). قد يكون كل LLSM مختلفا ويتطلب استراتيجيات محاذاة مختلفة ، خاصة تلك التي تم بناؤها في المنزل. قم بإجراء المحاذاة الروتينية المناسبة والمتابعة إلى القسم 2.

  1. أضف 10 مل من الماء بالإضافة إلى 30 ميكرولتر من الفلورسين (مخزون 1 مجم / مل) إلى حمام LLSM (~ 10 مل حجم) ، واضغط على Image (Home) لنقل الهدف إلى موضع الصورة ، وانظر إلى نمط شعاع ليزر Bessel واحد. قم بمحاذاة شعاع الليزر باستخدام الأدلة ومنطقة الاهتمام المحددة مسبقا (ROI) لجعل الشعاع نمطا رقيقا متوازنا في جميع الاتجاهات.
    1. يجب أن يظهر الشعاع أيضا مركزا في كاميرا الباحث. استخدم اثنين من أدوات ضبط إمالة المرآة ، وميكرومتر علوي ، وتركيز ، وطوق هدف انبعاث للضبط. انظر الشكل 1 أ و ب للحزمة المحاذاة بشكل صحيح.
  2. اغسل الحمام والأهداف بما لا يقل عن 200 مل من الماء لإزالة الفلورسين تماما.
  3. صورة حبات الفلورسنت القياسية في وسائط التصوير (المحضرة عن طريق لصق الخرز على غطاء 5 مم مع بولي إل ليسين ، انظر جدول المواد ؛ يمكن إعداده مسبقا وإعادة استخدامه) لوظيفة انتشار النقطة المادية (PSF) في وسائط التصوير.
    ملاحظة: يمكن أن يكون هناك حبة واحدة فقط في العرض للمعالجة لاحقا ، لذا حاول العثور على حبة بحد ذاتها في المشاهد أو يمكن اقتصاصها بسهولة للحصول على حبة واحدة.
    1. قم بتشغيل التدرج عن طريق ضبطه على 3 في مربع "نطاق X Galvo". اضغط على Live لعرض الحقل الحالي. تحرك على طول الاتجاه Z للعثور على الغطاء والخرز. ابحث عن مركز الخرزة عن طريق التحرك على طول Z ، واضغط على إيقاف لإيقاف الليزر مؤقتا. تحقق من 3D، واضغط على Center ثم اضغط على Execute. سيؤدي ذلك إلى جمع البيانات.
    2. اضبط مرآة الإمالة والياقة الموضوعية وميكرومتر التركيز البؤري يدويا للحصول على أعلى قيم رمادية، ثم اضبطها حسب الضرورة للحصول على الأنماط المناسبة لالتقاط المسح الضوئي الموضوعي و z galvo و z + objective (totPSF) ومسح العينة (samplePSF). انظر الشكل 1 C-F للحصول على إسقاطات الكثافة القصوى المعدلة بشكل صحيح.
      ملاحظه: تعمل أوضاع الالتقاط المختلفة (المسح الضوئي الموضوعي و z galvo و z + objective و sample scan) على تغيير كيفية تحرك ورقة الضوء عبر العينة. يجب استخدام جميع أوضاع المسح للمحاذاة.
    3. يوضح المسح الضوئي للعينة كيفية جمع البيانات أثناء التجربة. اجمع عينة PSF بالضغط على تنفيذ في وضع مسح العينة للانحراف وتفكك. قم بتغيير الليزر إلى ثلاثة أوضاع ألوان (488 ، 560 ، 647) واضغط على تنفيذ مرة أخرى.
      ملاحظه: نظرا لأن صور LLSM بزاوية (57.2 درجة) ، يتم جمع الصور الملتقطة في وضع "مسح العينة" بهذه الزاوية ، وبالتالي فهي "منحرفة". إزالة الانحراف هي عملية تصحيح هذه الزاوية و "إعادة محاذاة" الصورة إلى مكدس z حقيقي. يجب جمع هذه البيانات في وسائط التصوير وفي جميع القنوات التي سيتم تصويرها أثناء التجربة. إذا لم يتم جمع هذا بشكل صحيح ، فلن يتم إلغاء انحراف البيانات بشكل صحيح. وبالمثل ، تأكد من تسخين الوسائط إلى 37 درجة مئوية (أو درجة الحرارة التجريبية المطلوبة).

2. إعداد الخلايا باستخدام LLSM

  1. أضف 100,000 خلية عارضة للمستضد (APCs) (50 ميكرولتر) إلى غطاء دائري بقطر 5 مم واتركها تستقر لمدة 10 دقائق.
  2. دهن حامل العينة ثم أضف خلية الغطاء إلى أعلى إليه. أضف قطرة من وسائط التصوير إلى الجزء الخلفي من الغطاء لتجنب الفقاعات قبل وضعها في الحمام. قم بربط حامل العينة على البيزو، واضغط على الصورة (الصفحة الرئيسية).
  3. ابحث عن APC للصورة للتأكد من أن LLSM وبرنامج التصوير (انظر جدول المواد) يعملان بشكل صحيح.
    ملاحظه: نقوم بالتصوير بحجم خطوة 0.4 ميكرومتر مع 60 خطوة z و 10 مللي ثانية للوين مع ضبط التدرج على 3 ، مما ينتج عنه 1.54 ثانية لكل إطار من الصورة ثلاثية الأبعاد بدقة ~ 200 نانومتر XY و 400 نانومتر Z. قد تحتاج هذه الإعدادات إلى الضبط بناء على حجم الخلية ، ودقة z المطلوبة ، وقوة الإشارة من تقنية وضع العلامات الفلورية المستخدمة. سيختلف استخدام طاقة الليزر أيضا بناء على تقنية وضع العلامات الفلورية المستخدمة.
    1. اضغط على Live لعرض الصورة الحالية. تحرك على طول Z للعثور على الغطاء والخلايا.
    2. ابحث عن مركز APC عن طريق التحرك في الاتجاه Z ، ثم اضغط على إيقاف لإيقاف الليزر مؤقتا. تحقق من 3D وأدخل الإعدادات المطلوبة ، واضغط على Center ثم اضغط على تنفيذ. سيؤدي ذلك إلى جمع البيانات.
  4. اخفض المرحلة لوضع التحميل وأضف 50 ميكرولتر من الخلايا التائية في وسائط التصوير (100,000 خلية) بالتنقيط مباشرة فوق الغطاء. من الأفضل ترك قطرة تتشكل في نهاية طرف الماصة ثم لمس الطرف بسائل الحمام. ارفع المسرح للخلف بالنقر فوق "الصورة (العودة)".
  5. ابدأ التصوير. تأكد من ضبط حجم المكدس المطلوب وطول الفاصل الزمني. على سبيل المثال، صورة 60 z-stacks بحجم خطوة 0.4 ميكرومتر وإدخال 500 إطار زمني. (عادة) توقف عن التسجيل قبل الوصول إلى 500 إطار لتجنب التبييض الضوئي. استخدم الوضع المباشر للبحث عن أزواج الخلايا، وعندما تكون جاهزة وإدخال الإعدادات المطلوبة، اضغط على تنفيذ لتجميع البيانات. انظر الشكل 2 للحصول على مثال.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: محاذاة LLSM. (أ) نمط الشعاع المطلوب لتجربة التصوير LLSM. (ب) لقطة شاشة لعملية محاذاة الحزمة؛ على اليسار توجد نافذة التركيز التي تظهر الشعاع الضيق والمركز ؛ يوجد في الجزء العلوي الأيمن رسم بياني يوضح أن الشعاع يتركز داخل النافذة. في أسفل اليمين توجد كاميرا Finder ، والتي يجب أن تكون أيضا شعاعا رفيعا ومركزا. (ج) إسقاطات الكثافة القصوى (MIPs) للحبة بواسطة المسح...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أغطية مستديرة 5 مم أدوات الدقة العالمية 502040 للتصوير Alexa Fluor 488 المضاد للفأر TCR β سلسلة الأجسام المضادة بيو ليجند 109215 للتصوير ملح الصوديوم الفلورسين سيجما ألدريتش F6377 لمحاذاة المجهر FluoSpheres المجهرية المعدلة بالكربوكسيل ثيرمو فيشر العلمي F8810 لمحاذاة المجهر إيماريس Bitplane غير متاح تتبع البرمجيات; تشمل الخيارات الأخرى لبرامج التتبع Amira أو Trackmate (فيجي). مجهر ضوئي شعرية 3ط غير متاح المجهر المستخدم L-15 متوسط Leibovitz ، بدون فينول أحمر ثيرمو فيشر العلمي 21083027 للتصوير دفتر الشرائح 3ط غير متاح برنامج التصوير LLSM بولي L-يسين منتجات فينيكس للأبحاث P8920-100 مل للتصوير

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة