مقالة منهجية

الفحص المجهري للحقل المظلم لتصور ديناميكيات انتشار القضبان النانوية على غشاء الخلية

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Ge, F., et al. تصور ديناميكيات انتشار قضبان الذهب النانوية على غشاء الخلية باستخدام الفحص المجهري أحادي الجسيمات النانوية المظلمة. J. Vis. Exp. (2021).

< p class = "jove_content">في هذا الفيديو ، نصف تقنية الفحص المجهري للحقل المظلم (DFM) جنبا إلى جنب مع تحليل تتبع الجسيم الفردي (SPT) لمراقبة تفاعل قضبان الذهب البلازمونية النانوية مع غشاء الخلية لخط خلوي معين ذي أهمية. يسمح تحليل DFM و SPT المشترك بتصور حركة القضبان النانوية عبر غشاء الخلية بدقة زمانية مكانية عالية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. إعداد شريحة المجهر

ملاحظة: تستخدم خلايا U87 MG من الجيل الثالث إلى العاشر ذات النشاط العالي في تجارب SPT.

  1. قم بتعقيم أغطية 22 مم × 22 مم التي تم تنظيفها بالفعل بمحلول سمكة المفترس عن طريق الغمر في الإيثانول (99.9٪).
  2. استخدم الملقط لإخراج زلة الغطاء من محلول الإيثانول (الخطوة 1.1) وتعقيمها عن طريق حرق الإيثانول على اللهب. بمجرد حرق كل الإيثانول ، ضع أغطية في طبق زراعة الخلايا البلاستيكية (35 × 10 مم) مملوء ب 2 مل من وسط الخلية (بدون فينول أحمر).
  3. أضف 50 ميكرولتر من تعليق الخلية على الغطاء وادفع الطبق برفق ذهابا وإيابا ويسارا ويمينا لتوزيع الخلايا بالتساوي. ضعه في جو رطب.
  4. عندما تصل خلايا U87 MG على الغطاء إلى التقاء 20٪ -40٪ (~ 12 ساعة) ، أضف 20 ميكرولتر من CTAB-AuNRs (قضبان نانوية ذهبية يتم تصنيعها مع جزيء بروميد الأمونيوم سيتيل تري ميثيل الأمونيوم كعامل وقائي ، 138 pM) في الطبق وتشتت. احتضن في جو رطب لمدة 5 دقائق.
  5. أضف 100 ميكرولتر من وسط الثقافة (بدون فينول أحمر) من الطبق في الخطوة 1.4 إلى أخدود الشريحة الزجاجية المحززة (الشكل 1) التي يتم تنظيفها مسبقا بمحلول سمكة البيراها.
  6. أخرج الغطاء من الطبق واقلبه في الجزء العلوي من أخدود شريحة زجاج المجهر (الشكل 1). أغلقها بطلاء الأظافر ، واتركها تجف ، وضعها على المسرح لإجراء تجارب SPT.
< p class = "jove_title" >2. إجراء تجارب تتبع الجسيمات المفردة باستخدام الفحص المجهري للحقل المظلم (الشكل 1).

  1. ضع قطرة من الزيت على مكثف الحقل المظلم المغمور بالزيت (الفتحة العددية (NA) 1.43-1.20) وأدر المقبض لجعل المكثف يلامس الشريحة الزجاجية.
  2. ضع قطرة من الزيت في الجزء العلوي من زجاج الغطاء وأدر مقبض التركيز البؤري لجعل هدف الغمر بالزيت 60x (NA 0.7-1.25) يلمس الزيت.
  3. قم بتشغيل مصدر الضوء وقم بتدوير مقبض التركيز البؤري قليلا لتركيز مستوى التصوير.
    ملاحظه: في مجال الرؤية ، تكون الخلفية سوداء ، والخلايا ساطعة ، و CTAB-AuNRs (نسبة العرض إلى الارتفاع ~ 2: 1 ، الشكل 2) عبارة عن بقع مبعثرة صغيرة ملونة (حمراء أو صفراء أو خضراء).
  4. التقط عينة من الضوء المتناثر بواسطة كاميرا CMOS ملونة. انقر فوق "رمز الكاميرا" في البرنامج لتسجيل تنسيق TIFF وتصديره لحفظ الصور.

3. الحصول على البيانات

  1. استخراج مسار واحد طويل المدى
    1. تعمل كما هو موضح في الشكل 3 لتحويل صور المجال المظلم للسلسلة الزمنية من وضع "ألوان RGB" إلى وضع "8 بت". في الصورة J انقر فوق صورة | النوع | 8 بت. لضبط التباين، انقر فوق صورة | ضبط | السطوع | التباين.
    2. حدد جسيما مستهدفا وقم بقص خلفيات السلاسل الزمنية عن طريق وضع الخلفية وحذفها باستخدام "Ctrl + X".
    3. افتح نافذة اكتشاف الجسيمات وربط الجسيمات بالنقر فوق "الإضافات | مقتفي الجسيمات الكلاسيكية | تعقب الجسيمات".
    4. قم بتعيين نصف القطر إلى 6 ، والقطع إلى 0 ، والنسبة المئوية إلى 0.01٪.
      ملاحظه: لاكتشاف الجسيم، اضبط المعلمات الثلاث المذكورة أعلاه بمساعدة المعاينة. تأكد من أن نصف القطر أكبر قليلا من الجسيم المستهدف وأصغر من أصغر فصل بين الجسيمات. النسبة المئوية هي الحد الأدنى لتوزيع الشدة التي يجب أن تكون جسيمات مرشحة.
    5. اضبط نطاق الارتباط على 5 والإزاحة إلى 10.
      ملاحظه: لربط الجسيم بين الإطارات المتجاورة المتتالية ، اضبط المعلمتين أعلاه. الإزاحة هي الحد الأقصى لوحدات البكسل التي يمكن أن يتحرك بها الجسيم بين إطارين متتاليين، ونطاق الارتباط هو عدد الإطارات المتتالية التي يجب مراعاتها عند تحديد أفضل تطابق مقابل.
    6. انقر فوق "موافق" لفتح نافذة ParticleTracker Results لرؤية النتائج.
    7. انقر فوق "تصور جميع المسارات" لفحص المسارات التي تم إنشاؤها.
    8. انقر فوق قائمة "إعادة ربط الجسيمات" في الجزء العلوي لإعادة ربط الجسيمات المكتشفة بنطاقات ارتباط مختلفة ومعلمات النسبة المئوية ، إذا كان المسار الذي تم إنشاؤه بواسطة البرنامج لا يتطابق مع المسار المتحرك ل AuNR.
    9. انقر فوق "حفظ التقرير الكامل" لحفظ النتائج إذا كان المسار الذي تم إنشاؤه بواسطة البرنامج والمسار المتحرك ل AuNR متطابقين.
      ملاحظة: يظهر مثال على استخراج مسار واحد طويل المدى باستخدام الصورة J في الشكل 4.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: رسم تخطيطي للمسار البصري للفحص المجهري للحقل المظلم ، وإعداد شريحة المجهر ، وطريقة فرق القناة المزدوجة لحساب الزاوية القطبية (θ) ل AuNRs. شريط المقياس في الصورة هو 2 ميكرومتر.

figure-results-2
الشكل 2: توصيف CTAB-AuNRs. (أ) صور TEM ل CTAB@AuNRs. (ب) أطياف LSPR من CTAB@AuNRs. (ج

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قضبان نانوية ذهبية مطلية ب CTAB (CTAB-AuNRs) نانوسيدز رقم 40-650 85 نانومتر * 40 نانومتر كاميرا CMOS ملونة أوليمبوس موانئ دبي 74 اليابان أغطية سيتوغلاس z10212222C 22 * 22 ملم الفحص المجهري للمجال المظلم نيكون 80ط مجهر عمودي مصل الأبقار الجنينية (FBS) جيبكو 10099141 فيجي المعاهد الوطنية للصحة 2.0.0-RC-69/1.52 ص توزيع ImageJ شريحة زجاجية مخددة ماركة الشراع 7103 ريال مقعر واحد الصورة J الصورة J 1.52 [ج] متلاب الرياضيات R2019b كود MATLAB https://github.com/fenggeqd/ جوف-2020 أطباق زراعة الخلايا البلاستيكية صقر 353002 أطباق زراعة الخلايا البلاستيكية صقر 353001 35 * 10 ملم خلية U87 MG مجموعة ثقافة النوع الأمريكي ATCC HTB-14 خط خلايا الورم الأرومي الدبقي الأولي البشري الحد الأدنى من الوسط الأساسي (MEM) جيبكو 51200038 لا يوجد فينول أحمر البنسلين - ستربتومايسين جيبكو 15140122

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة