$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
p class = "jove_title" >1. تعديل المجهر والعدسة الموضوعية
- أدخل مرآة 50/50 في عجلة المرشح لمجهر الفلورسنت باستخدام مكعب مرشح مناسب (الشكل 1). تعامل مع المرآة 50/50 بحذر حيث غالبا ما يكون لديهم طلاء مضاد للانعكاس.
ملاحظه: استخدمنا مرآة 50/50 في مكعب مرشح فارغ من المجهر. يتم إدخال المرآة 50/50 حيث توجد المرآة ثنائية اللون.
- استخدم هدف زيت تكبير عال / فتحة عددية عالية (NA).
ملاحظه: في هذا البروتوكول ، استخدمنا هدف 100x / 1.3 NA.
< p class = "jove_title" >
2. تحضير الغرفة للصق الأنابيب الدقيقة على السطح
- نظف شرائح المجهر وأغطية 22 مم × 22 مم (للمجهر العمودي) أو أغطية 22 مم × 22 مم و 18 مم × 18 مم (للمجاهر المقلوبة). قم بتعديل السطح حسب الحاجة. على سبيل المثال ، قم بتنظيف الأغطية باستخدام منظف قلوي (انظر جدول المواد) متبوعا بالإيثانول بنسبة 100٪ مع غسل الماء المقطر بين وبعد ذلك.
- قم بقص شرائط بعرض 3 مم من فيلم البارافين البلاستيكي (انظر جدول المواد) باستخدام شفرة حلاقة وشريحة مجهر أخرى كحافة.
- ضع شريطين بلاستيكيين من فيلم البارافين على بعد 3 مم على زلة غطاء نظيفة مقاس 22 × 22 مم. ثم ضع غطاء مقاس 18 مم × 18 مم لتشكيل قناة. إذا كنت تستخدم مجهرا عموديا ، فضع الشرائط فوق شريحة مجهر نظيفة ثم ضع غطاء في الأعلى.
- ضع الغطاء (أو الشريحة) على كتلة حرارية عند 100 درجة مئوية لمدة 10-30 ثانية حتى يشكل فيلم البارافين قناة مغلقة.
- تدفق 50 ميكروغرام / مل من الجسم المضاد (في Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) عن طريق التروية باستخدام ماصة. احتضان لمدة 10 دقائق
ملاحظه: نستخدم الأجسام المضادة للرودامين لربط بذور الأنابيب الدقيقة المسماة بالرودامين بالسطح. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام أفيدين لربط بذور الأنابيب الدقيقة المسماة بالبيوتين أو بجزيئات الذهب البيوتينية. لإلقاء نظرة ببساطة على الأنابيب الدقيقة في حالة عدم وجود توبولين في المحلول (أي اختبار غير ديناميكي) ، يمكن استخدام جسم مضاد مضاد للتوبولين.
- اغسل خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت BRB80. يوصى بتصفية المحاليل باستخدام مرشح 0.22 ميكرومتر.
- تدفق في 1٪ بولوكسامير 407 (بوليمر ثلاثي الكتل) في BRB80 لمنع السطح ضد الارتباط غير المحدد. احتضن لمدة 10 دقائق.
- اغسل خمس مرات باستخدام المخزن المؤقت BRB80.
- العينة جاهزة لوضعها على المجهر. لمنع العينة من الجفاف ، أضف قطرتين من المخزن المؤقت BRB80 في نهايات القناة وقم بتجديده عند الحاجة.
فئة < ص = "jove_title" >
3. محاذاة المجهر
- ضع العينة على مرحلة المجهر. قم بتشغيل مصدر ضوء إضاءة epi.
- ركز على سطح العينة. ستلاحظ أسطحا متعددة حيث يتم تحريك الهدف لأعلى ولأسفل بسبب الانعكاس الخلفي للضوء من البصريات داخل المسار البصري. طريقة جيدة للعثور على سطح العينة هي التركيز على حافة فيلم البارافين. بمجرد العثور على السطح ، اضبط مجال الرؤية على مركز الغرفة.
- قم بتوسيط الحجاب الحاجز الميداني في مجال الرؤية عن طريق إغلاقه حتى المنتصف واستخدام براغي الضبط. بمجرد المحاذاة ، أعد فتح الحجاب الحاجز.
ملاحظه: يجب إجراء تعديل المسمار بشكل متقطع فقط ، ربما كل 3-6 أشهر أو عند استكشاف الأخطاء وإصلاحها.
- قم بالتمرير في عدسة برتراند لعرض تلميذ الخروج (المستوى البؤري الخلفي) للهدف.
- أغلق غشاء فتحة العدسة (AD) خارج حواف تلميذ الخروج للهدف.
- استخدم براغي الضبط لتوسيط AD مع تلميذ الخروج. تحقق مرة أخرى عن طريق فتح AD ومطابقة حوافه مع حواف تلميذ الخروج.
ملاحظه: يجب إجراء هذا التعديل بشكل متقطع فقط.
- اضبط غشاء الفتحة على حوالي 2/3 من NA للهدف.
فئة
4. تصوير الأنابيب الدقيقة المستقرة أو جسيمات الذهب 40 نانومتر
< p class = "jove_content" >
ملاحظة: تعمل الأنابيب الدقيقة المستقرة وجسيمات الذهب النانوية كعينات تحكم جيدة. يوصى بتصوير الأنابيب الدقيقة المتصلة بالسطح أو الجسيمات النانوية الذهبية كخطوة أولى لتقييم أداء IRM والمساعدة في ضبط فتحة الحجاب الحاجز المثلى (القسم 7).
- اضبط وقت التعرض للكاميرا على 10 مللي ثانية واضبط الإضاءة لتشبع النطاق الديناميكي للكاميرا تقريبا.
- تدفق في 10 ميكرولتر من الأنابيب الدقيقة المستقرة بجوانيل-(ألفا، بيتا)-الميثيلين ثنائي الفوسفونات (GMPCCP)- أو الأنابيب الدقيقة المستقرة بالتاكسول في BRB80 (أو جزيئات الذهب 40 نانومتر) عن طريق التروية باستخدام ماصة إلى عينة جديدة ومراقبة الارتباط عن طريق تصوير السطح. بمجرد ربط 10-20 أنبوبا دقيقة في مجال الرؤية ، اغسل العينة 2x باستخدام BRB80.
ملاحظه: باستخدام مجهر محاذاة جيدا ، يجب أن تكون الأنابيب الدقيقة مرئية دون طرح الخلفية.
- احصل على 10 صور عن طريق تعيين فاصل زمني مع فترة تأخير ثانية واحدة لمدة 10 ثوان (عند تعريض ضوئي يبلغ 10 مللي ثانية).
- الحصول على صورة خلفية. للقيام بذلك ، حرك المرحلة باستخدام وحدة التحكم في المسرح أو برنامج الكمبيوتر على طول المحور الطويل للقناة مع الحصول على 100 صورة دون تأخير (على سبيل المثال ، البث بالقرب من 100 إطارا في الثانية @ 10 مللي ثانية تعرض).
ملاحظه: الخلفية هي متوسط 100 صورة. من خلال أخذ الوسيط ، يتم الحفاظ على ملف تعريف الإضاءة والميزات الثابتة الأخرى مثل الأوساخ الموجودة على البصريات بينما يتم تصفية كل شيء آخر. يجب ألا يكون هناك ميل على العينة لأن هذا سيؤدي إلى تغيير في الموضع المحوري أثناء تحريك المرحلة ويؤدي في النهاية إلى تدهور صورة الخلفية. إذا تعذر تجنب الإمالة ، فإن الطريقة البديلة هي الحصول على صور خلفية متوسطة قبل تدفق البذور.
- لمعالجة الصور وتحليلها ، انتقل إلى الخطوة 6.
< p class = "jove_title" >
5. تصوير ديناميكيات الأنابيب الدقيقة
- بالنسبة لديناميكيات الأنابيب الدقيقة باستخدام أنابيب الدماغ ، اضبط درجة حرارة سخان العينة على 37 درجة مئوية.
- تدفق 10 ميكرولتر من بذور الأنابيب الدقيقة المستقرة ب GMPCCP في BRB80 عن طريق التروية باستخدام ماصة إلى عينة جديدة ومراقبتها وهي مرتبطة بالسطح عن طريق تصوير السطح مباشرة (أي أثناء البث). بمجرد ربط 10-20 بذرة بمجال الرؤية ، اغسل العينة باستخدام حجم قناة 2x مع BRB80 (يجب تسخين BRB80 مسبقا إلى 37 درجة مئوية أو على الأقل في درجة حرارة الغرفة).
ملاحظه: باستخدام مجهر محاذاة جيدا ، يجب أن تكون البذور مرئية دون طرح الخلفية.
- التدفق في مزيج البلمرة (7.5 ميكرومتر توبولين غير مسمى + 1 ملي مولار جوانوزين ثلاثي الفوسفات (GTP) + 1 ملي مولار ديثيوثريتول (DTT) في المخزن المؤقت BRB80). لقياس نمو الأنابيب الدقيقة ، قم بتعيين فاصل زمني باستخدام برنامج الاقتناء للحصول على صورة كل 5 ثوان (0.2 إطار في الثانية (fps)) لمدة 15 دقيقة.
- لتحسين التباين ، احصل على 10 صور (بدلا من واحدة) في كل نقطة زمنية ومتوسطها. بالنسبة لانكماش الأنابيب الدقيقة ، احصل على صور بمعدل 100 إطارا في الثانية عن طريق ضبط التأخير الزمني على 0 ووقت التعرض 10 مللي ثانية (يمكن إجراء إطارات أعلى في الثانية مع مناطق أصغر ذات أهمية اعتمادا على الكاميرا المستخدمة).
- احصل على صورة خلفية كما في الخطوة 4.4.
< p class = "jove_title" >
6. معالجة الصور وتحليلها
ملاحظة: للتحليل، يستخدم هذا البروتوكول فيجي، لكن القارئ حر في استخدام أي برنامج يراه مناسبا.
- افتح صور الخلفية المحفوظة.
- احسب الصورة المتوسطة (أي الخلفية) باستخدام مشروع Image > Stack > Z > Median.
- افتح فيلم ديناميكيات الأنابيب الدقيقة كمكدس (نفس الشيء بالنسبة للأنابيب الدقيقة غير الديناميكية) باستخدام File > Open.
- اطرح صورة الخلفية من المكدس باستخدام حاسبة > الصور. تأكد من التحقق من خيار "نتيجة 32 بت (تعويم)".
- بالنسبة للأنابيب الدقيقة الديناميكية ، باستخدام أداة الخط ، ارسم خطا على طول الأنابيب الدقيقة محل الاهتمام وأضفه إلى مدير منطقة الاهتمام بالضغط على "t". كرر مع جميع الأنابيب الدقيقة ذات الأهمية.
- بالنسبة للأنابيب الدقيقة الديناميكية، قم بتشغيل ماكرو Multi-Kymo. سيقوم الماكرو بإنشاء مقطع فيديو وجهاز كيموغراف لكل أنبوب دقيق في مدير عائد الاستثمار. ستحصل كل أنابيب دقيقة على معرف فريد.
- بالنسبة للأنابيب الدقيقة الديناميكية ، قم بتشغيل ماكرو Kymo-Analysis واتبع خطواته لقياس معدلات النمو ومعدلات الانكماش للأنابيب الدقيقة.
7. حجم الحجاب الحاجز لفتحة العدسة
ملاحظة: أحد العوامل المهمة للحصول على صور عالية التباين للأنابيب الدقيقة باستخدام IRM هو ضبط فتحة الإضاءة الرقمية (INA) بشكل صحيح. يمكن تغيير INA عن طريق تغيير حجم شعاع الإضاءة الوارد في تلميذ خروج الهدف والذي يتم التحكم فيه بواسطة حجم AD (يقع AD في مستوى مترافق مع تلميذ الخروج (المستوى البؤري الخلفي) للهدف ، الشكل 1):
حيث يكون DAD هو قطر الحجاب الحاجز للفتحة ، وf الهدف هو البعد البؤري للهدف و Dep هو قطر تلميذ خروج الهدف. عادة ، يتم ترك AD مفتوحا بالكامل للتصوير الفلوري ، لذلك يساوي INA NA الهدف. في المجهر الفلوري ، لا يشير مقياس AD إلى قطره ، وبالتالي لا يمكن حساب INA. من الممكن معايرة حجم AD بمساعدة هدف. ومع ذلك ، فهذا ليس ضروريا لأن حجم AD سيكون ثابتا على الحجم الذي ينتج أعلى تباين.
- قم بإعداد عينة من الأنابيب الدقيقة المستقرة المصنفة بالفلورسنت والملتصقة بالسطح (الخطوات 4.1-4.2).
ملاحظه: استخدمنا الأنابيب الدقيقة المسماة رباعي ميثيل رودامين (على سبيل المثال: 550 نانومتر ، Em: 580 نانومتر).
- اجعل الأنابيب الدقيقة في بؤرة التركيز باستخدام مقبض التركيز المجهري أثناء تصويرها بالفلورسنت (إذا لم يتم تصنيف الأنابيب الدقيقة ، فقم بتصويرها باستخدام IRM أو DIC).
- اضبط تعرض الكاميرا على 10 مللي ثانية باستخدام برنامج الكاميرا.
ملاحظه: هذا التعرض تعسفي وسيعمل أيضا التعرض لمدة 100 مللي ثانية.
- أغلق AD إلى أصغر فتحة له. اضبط الإضاءة لتشبع النطاق الديناميكي للكاميرا تقريبا أو إلى أقصى حد ممكن.
ملاحظه: كدليل، استخدم جدول البحث الذي يوفره برنامج الاستحواذ عادة.
- احصل على 10 صور (عن طريق دفق أو التقاط صورة كل ثانية) لمجال رؤية يحتوي على 10+ أنابيب دقيقة.
- احصل على صورة خلفية كما في الخطوة 4.4.
- قم بتغيير حجم AD وكرر الخطوات 7.5-7.6 لنطاق فتح AD بالكامل (من مغلق إلى حجم تلميذ الخروج، الشكل 2). في كل مرة يتم فيها تغيير حجم AD، اضبط شدة الإضاءة لتتناسب مع شدة الخطوة 7.4.
- لكل مجال رؤية تم الحصول عليه ، اطرح الخلفية المقابلة باستخدام حاسبة الصورة > العملية واختر "طرح" من القائمة المنسدلة. تأكد من تحديد خيار "نتيجة 32 بت (تعويم)". ثم متوسط الصور الناتجة باستخدام مكدس > الصورة > مشروع Z> متوسط.
- قم بقياس نسبة ضوضاء الإشارة إلى الخلفية (SBR) للأنابيب الدقيقة المحددة على أنها متوسط شدة إشارة الأنابيب الدقيقة (شدة الأنابيب الدقيقة مطروحا منها شدة الخلفية) مقسومة على الانحراف المعياري للخلفية (الشكل 3).
- حدد الحجم الأمثل ل AD (أي INA الأمثل) عن طريق حساب متوسط SBR للأنابيب الدقيقة لكل حجم فتحة ، وتعيين حجم AD على الحجم الذي ينتج أعلى SBR (الشكل 2). من الممكن أن يكون هناك مجموعة من أحجام AD التي تنتج تباينا مماثلا.
