Method Article

الفحص المجهري للقوة الذرية الساكنة لتصور وتوصيف النيوكليوسومات المجمعة

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Stormberg، T.، et al. استكشاف بنية وديناميكيات النيوكليوسومات باستخدام التصوير المجهري للقوة الذرية. J. Vis. Exp.(2019)

في هذا الفيديو ، نوضح الفحص المجهري للقوة الذرية الساكنة لتصور النيوكليوسومات المجمعة. تسمح تقنية التصوير عالية الدقة هذه بدراسة بنية النيوكليوسوم.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
فئة

1. وظيفية سطح الميكا لتصوير AFM الثابت للنيوكليوسومات

  1. قم بإعداد محلول مخزون 50 ملي مولار 1- (3-أمينوبروبيل) سيلاتران APS في الماء منزوع الأيونات كما هو موضح. قم بتخزين 1 مل من هذا المحلول عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
    ملاحظه: يمكن تخزين الحصص لأكثر من عام عند 4 درجات مئوية.
  2. قم بإعداد محلول APS 1: 300 لتعديل الميكا عن طريق إذابة 50 ميكرولتر من مخزون 50 ملي مولار APS في 15 مل dd H2O.
    ملاحظه: يمكن تخزين حل العمل هذا في درجة حرارة الغرفة لعدة أيام.
  3. قطع شرائح الميكا مقاس 1 × 3 سم من صفائح الميكا عالية الجودة (انظر جدول مواد الميكا المستخدمة هنا).
    1. تأكد من أن القطعة مناسبة عند وضعها قطريا في كوفيت. استخدم طرف الملقط الحاد أو شفرة الحلاقة أو الشريط اللاصق لشق طبقات الميكا حتى يتشقق كلا الجانبين حديثا وتصبح القطعة رفيعة مثل ~ 0.1 مم (الشكل 1 أ). ضع قطعة الميكا على الفور في الكوفيت المملوء ب APS واحتضانها لمدة 30 دقيقة (الشكل 1 ب).
  4. انقلي قطعة الميكا إلى كوفيت مملوء ب dd H2O وانقعيها لمدة 30 ثانية (الشكل 1 ج). جفف تماما جانبي شريط APS-mica تحت تدفق الأرجون.
    ملاحظه: يمكن استخدام مناديل غرف الأبحاث السليلوز والبوليستر غير المنسوجة (المسنحة الموصى بها مفصلة بالمواد) للمساعدة في امتصاص الماء من حافة الميكا عند التجفيف.
  5. استخدم شريط الميكا الجاف الآن لتحضير العينة. خلاف ذلك ، قم بتخزين القطعة في كوفيت نظيف وجاف (الشكل 1 د).
    ملاحظه: يوصى بتخزين إضافي في فراغ لمدة 1-2 ساعة عندما تكون البيئة رطبة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

2. تحضير عينات النيوكليوسوم على APS-Mica لتصوير AFM الثابت

  1. ضع شريطا لاصقا مزدوج الوجه على عدة كرات الصولجان المغناطيسية وضعها على الجانب.
  2. قم بقص الركيزة APS-mica إلى الحجم المطلوب (مربعات 1 × 1 سم لأداة MM AFM المستخدمة هنا). ضع هذه القطع في طبق بتري نظيف واحتفظ بها مغطاة.
  3. قم بإعداد ثلاثة تخفيفات من النيوكليوسومات المجمعة (تركيزات النيوكليوسوم النهائية 0.5 و 1.0 و 2.0 نانومتر) باستخدام مخزن مؤقت مفلتر 0.22 ميكرومتر يحتوي على 10 ملي مولار HEPES درجة حموضة 7.5 و 4 ملي مولار MgCl2.
    ملاحظه: للحد من فقدان النيوكليوسومات عند التركيز النهائي المنخفض ، يجب إجراء التخفيفات واحدة تلو الأخرى ، مباشرة قبل الترسيب على APS-ميكا.
  4. قم بإيداع 5-10 ميكرولتر من عينة النيوكليوسوم المخففة في وسط قطعة APS-mica ، واتركها تحتضن لمدة دقيقتين. اشطف العينة برفق باستخدام 2-3 مل من dd H2O لإزالة جميع مكونات العازلة. بعد استخدام كل ~ 0.5 مل من dd H2O ، رج الميكا برفق لإزالة ماء الشطف الزائد.
    ملاحظه: يوصى باستخدام حقنة يمكن التخلص منها لخطوة الشطف هذه.
  5. جفف العينة المترسبة تحت تدفق خفيف من غاز الأرجون النظيف.
    ملاحظه: العينة جاهزة الآن للتصوير أو يمكن تخزينها في خزانة مفرغة أو مجفف مملوء بالأرجون. تم تصوير العينات المعدة والمخزنة على النحو الموصوف بعد عام واحد من التحضير دون فقدان الجودة. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
< p class = "jove_title" >3. تصوير AFM الثابت للنيوكليوسومات

  1. قم بتركيب طرف AFM على حامل الطرف. استخدم طرفا له ثابت زنبركي ~ 40 نيوتن / م وتردد رنين بين 300 و 340 كيلو هرتز (انظر جدول المواد للناتئ المستخدم هنا).
  2. قم بتركيب العينة المعدة في القسم 3 على مرحلة AFM مع الحرص على عدم ملامسة سطح العينة.
  3. ضع الليزر فوق الكابولي حتى يصل المجموع إلى الحد الأقصى واضبط قيم الانحراف الرأسي والجانبي على ما يقرب من الصفر.
  4. اضبط مسبار AFM للعثور على تردد الرنين الخاص به وضبط سعة محرك الأقراص واضبط حجم الصورة على 100 × 100 نانومتر. انقر فوق الزر "إشراك" لبدء النهج.
  5. بمجرد الاقتراب ، قم بتحسين نقطة ضبط السعة تدريجيا حتى يظهر سطح العينة بوضوح. قم بزيادة حجم المسح الضوئي إلى 1 × 1 ميكرومتر والدقة إلى 512 × 512 بكسل. انقر فوق زر الالتقاط متبوعا بزر المشاركة لبدء الحصول على الصورة.
    ملاحظه: تظهر الصور في الشكل 2 الخلفية السلسة التي يمكن توقعها عند تصوير هذه العينات.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" >figure-results-1
الشكل 1: تخطيطي لعملية تحضير الميكا الوظيفية APS لتصوير AFM للنيوكليوسومات. (أ) قطعة من الميكا بسمك ~ 0.1 مم لها شق حديثا. (ب) يتم وضع قطعة الميكا المشقوقة على الفور قطريا في كوفيت يحتوي على محلول APS ويتم ضبطها على الحضانة لمدة 30 دقيقة. (ج) بعد خطوة تشغيل APS ، يتم نقل قطعة الميكا APS إلى كوفيت مملوء ب dd H2O لشطف لمدة 30 ثانية. (د) يتم تخزين قطعة APS-mica في كوفيت حتى الاستخدام.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Materials

List of materials used in this article Name Company Catalog Number Comments CENP-A / H4) 2 ، إنسان مؤتلف إبي سايفر ، دورهام ، نورث كارولاينا 16-0010 رقم الكتالوج ل 50 ug H2A / H2B ، مؤتلف الإنسان إبي سايفر ، دورهام ، نورث كارولاينا 15-0311 رقم الكتالوج ل 50 ug H3 Octamer ، إنسان مؤتلف إبي سايفر ، دورهام ، نورث كارولاينا 16-0001 رقم الكتالوج ل 50 ug طقم جهاز غسيل الكلى Slide-A-Lyzer MINI، 10K MWCO، 0.1 مل ThermoFischer Scientific ، والثام ، ماساتشوستس 69574 رقم الكتالوج ل 10 أجهزة كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري S9888-500G رقم الفهرس ل 500 مجم مرشحات الطرد المركزي Amicon Ultra-0.5 مل ميليبور سيجما ، برلنغتون ، ميزوري UFC501008 رقم الكتالوج ل 8 أجهزة حمض الهيدروكلوريك سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري 258148-25 مل رقم الكتالوج ل 25 مل تريسين سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري تي 0377-25 جي رقم الكتالوج ل 25 جم الحزب الديمقراطي الصربي سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري 11667289001 رقم الكتالوج ل 1 كجم بيرسلفات الأمونيوم (AmmPS) بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا هاتف: 1610700 رقم الكتالوج ل 10 جم 30٪ محلول أكريلاميد / مكرر ، 37.5: 1 بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا 1610158 رقم الكتالوج ل 500 مل تيميد بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا هاتف: 1610800 رقم الكتالوج ل 5 مل 4x عينة بروتين Laemmli عازلة ل SDS-PAGE بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا 1610747 رقم الكتالوج ل 10 مل 2-أنا سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري M6250-10 مل رقم الكتالوج ل 10 مل ageRuler سلم البروتين الملون ThermoFischer Scientific ، والثام ، ماساتشوستس هاتف: 26616 رقم الفهرس ل 500 ميكرولتر صبغة Coomassie الآمنة™ بيولوجيا بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا 1610786 رقم الفهرس ل 1 لتر مناديل غرف الأبحاث غير المنسوجة: TX604 TechniCloth تكس وايب ، كيرنرسفيل ، نورث كارولاينا TX604 موسكوفيت بلوك ميكا آشفيلميكا ، نيوبورت نيوز ، فيرجينيا الصف -1 هيبس سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري H4034-25G رقم الكتالوج ل 25 جم سكوتش الشريط سكوتش 3 م ، سانت بول ، مينيسوتا مسبار TESPA-V2 AFM (للتصوير الثابت) مسبار بروكر AFM ، كاماريلو ، كاليفورنيا مرشح Millex-GP ، 0.22 ميكرومتر سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري SLGP05010 رقم الكتالوج ل 10 أجهزة مسبار BL-AC10DS-A2 AFM (ل HS-AFM) أوليمبوس ، اليابان مجهر القوة الذرية متعدد الأوضاع بروكر نانو / فيكو ، سانتا باربرا ، كاليفورنيا

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Atomic Force MicroscopyNucleosome VisualizationMica Surface FunctionalizationAPS Solution PreparationNucleosome DepositionContact Mode ImagingTopographic Image GenerationAFM Probe AlignmentElectrostatic BindingNucleosome Structure Analysis

Related Articles