الفحص المجهري للقوة الذرية بفاصل زمني عالي السرعة لالتقاط ديناميكيات النيوكليوسوم

الملخص

المصدر: Stumme-Diers ، M. P. ، et al. ، Investigation the structure and dynamics of nucleosomes باستخدام التصوير المجهري للقوة الذرية.J. Vis. Exp.(2019)

في هذا الفيديو ، نوضح الفحص المجهري عالي السرعة للقوة الذرية بفاصل زمني ، AFM ، تقنيات التصوير لدراسة ديناميكيات مجمعات النيوكليوسوم. عندما يقوم طرف AFM بمسح سطح النيوكليوسوم ، فإنه يكتشف التغيرات في ارتفاع النيوكليوسوم ويسجل فك الحمض النووي بمرور الوقت.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تجميع التخفيف المستمر للنيوكليوسومات الأحادية

1. قم بإنشاء وتنقية ركيزة الحمض النووي بحجم 400 نقطة أساس تقريبا تحتوي على تسلسل تحديد موضع النيوكليوسوم Widom 601 غير المركزي. < / > ملاحظه: للحد من التكوين غير المرغوب فيه لثنائي النيوكليوسومات ، يجب ألا يتجاوز كل "ذراع" يحيط بتسلسل تحديد المواقع ~ 150 نقطة أساس.
   1. استخدم البلازميد pGEM3Z-601 جنبا إلى جنب مع الاشعال المصممة وتضخيم الحمض النووي للركيزة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). بالنسبة للركيزة 423 نقطة أساس مع أطوال ذراع 122 و 154 نقطة أساس المستخدمة هنا ، استخدم بادئات أمامية (5'-CAGTGAATTGTGTAATACGACTC-3') وخلفية (5'-ACAGCTATGACGATTAC-3').
   2. أضف الأنابيب التي تحتوي على خليط التفاعل إلى جهاز تدوير حراري مسخن مسبقا إلى 95 درجة مئوية. قم بتشغيل البرنامج التالي لمدة 33 دورة بعد التمسخ الأولي لمدة 5 دقائق عند 95 درجة مئوية: 30 ثانية من التمسخ عند 95 درجة مئوية ، و 30 ثانية من التلدين عند 49 درجة مئوية ، وتمديد 35 ثانية عند 72 درجة مئوية.
   3. قم بتنقية الحمض النووي من خليط تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنقية تفاعل البوليميراز المتسلسل المتوفرة تجاريا. عند مسح الحمض النووي من عمود تنظيف تفاعل البوليميراز المتسلسل ، استخدم 10 ملي مولار مخزن مؤقت Tris (الرقم الهيدروجيني 7.5) بدلا من المخزن المؤقت للشطف المقدم من المجموعة.
      ملاحظه: احرص على عدم نقل المخازن المؤقتة بين خطوات التنقية. يمكن أن يتسبب المسائل الملوثة في حدوث مشكلات في اتجاه مجرى النهر عند قياس تركيز الحمض النووي و / أو يمكن أن يغير تركيز الملح الأولي لخليط تجميع النيوكليوسوم.
2. حدد تركيز الحمض النووي عن طريق قياس امتصاص الحمض النووي المنقى عند 260 نانومتر.
   1. اجمع فارغا على مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية VIS باستخدام المخزن المؤقت للشطف 10 ملي مولار فقط Tris pH 7.5. اجمع قياسا للحمض النووي المنقى.
3. مع تحديد التركيز ، قم بنقل 25 ملي مول من الحمض النووي المنقى في أنبوب ميكرو بسعة 0.6 مل ووضعه في جهاز طرد مركزي مفرغ حتى يصبح المحلول بالكاد مرئيا ؛ هذا عادة ما يكون من 30 دقيقة إلى 1 ساعة < / > ملاحظه: ركيزة الحمض النووي جاهزة الآن لتجميع النيوكليوسوم. خلاف ذلك ، يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا وتخزين الحمض النووي عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
4. ضع أنبوب الطرد الدقيق الذي يحتوي على 25 pmol DNA على الجليد وأضف مكونات تجميع النيوكليوسوم في الجدول 1 ، بالترتيب المذكور. عند إضافة جميع المكونات ، أخرج الخليط من الثلج واحتضنه في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 30 ><دقيقة. ملاحظه: من الأهمية بمكان أن يؤخذ في الاعتبار محتوى الملح في مخزن هيستون المخزون عند حساب كلوريد الصوديوم اللازم لتحقيق التركيز النهائي 2 M.
5. قم بتجميع النيوكليوسومات عن طريق تقليل تركيز الملح 2 M للخليط إلى 200 ملي مولار باستخدام تخفيف معدل مستمر.
   1. املأ حقنة ب 100 ميكرولتر من محلول التخفيف الذي يحتوي على 10 ملي مولار من الرقم الهيدروجيني Tris 7.5 وضعه على مضخة حقنة.
   2. قم بتوجيه إبرة المحقنة من خلال فتحة مثقوبة مسبقا في غطاء أنبوب الطرد الدقيق ، مما يضمن التلامس مع خليط التجميع (الشكل 1).
   3. قم بتشغيل مضخة الحقنة بمعدل 0.75 ميكرولتر / دقيقة لمدة 120 دقيقة < / > ملاحظه: يحتوي المحلول الناتج 100 ميكرولتر على 250 نانو مولار نيوكليوسومات و 200 ملي كلوريد الصوديوم.
   4. انقل الخليط إلى زر غسيل الكلى 10 K MWCO وقم بغسيل الكلى مقابل 200 مل من محلول ملح منخفض المبرد مسبقا (4 درجات مئوية) يحتوي على 10 ملي مولار من درجة الحموضة ثلاثية 7.5 و 0.25 ملي مولار EDTA و 2.5 ملي كلوريد الصوديوم ، لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
6. لتقييم محتوى الهيستون لمجموعة النيوكليوسوم ، قم بإعداد جل SDS-PAGE متقطع مع فصل 15٪ وتكديس 6٪ كما هو موضح سابقا.
   1. Aliquot 10 - 20 ميكرولتر من مخزون النيوكليوسوم إلى أنبوب الطرد الدقيق وإضافة 4x Laemmli Sample Buffer إلى تركيز عمل من 1 - 2x.
   2. كعنصر تحكم ، كرر هذا المستحضر في أنبوب ميكرو فوج منفصل ل 1-2 ميكروغرام من مخزون هيستون. سخني العينات عند 95 درجة مئوية لمدة ~ 5 دقائق.
   3. قم بتحميل العينات في الممرات المجاورة لبعضها البعض على الجل. أضف عينة من المخزن المؤقت إلى الممرات غير المستخدمة لتعزيز ترحيل النطاق المتساوي.
   4. قم بتشغيل الجل على 65 فولت حتى تتحرك مقدمة الصبغة عبر جل التكديس. عند الوصول إلى الجل المنفصل ، قم بزيادته إلى 150 فولت وقم بتشغيله حتى تنتقل واجهة الصبغة تماما من الجل.
   5. قم بتفكيك وحدة الرحلان الكهربائي وانقل الجل برفق إلى وعاء تلطيخ مملوء ب dd H₂O. دع الجل يجلس لمدة 5 دقائق مع تحريك لطيف. كرر هذه العملية مرتين أخريين مع استخدام dd H₂O الطازج في كل مرة.
      ملاحظه: لا تتطلب صبغة Coomassie المستخدمة في هذا البروتوكول خطوات التثبيت النموذجية اللازمة لبقع Coomassie (انظر جدول المواد). إذا تم استخدام مستحضر Coomassie آخر ، فاضبط خطوات التثبيت حسب الحاجة.
   6. قم بإزالة الماء من الشطف النهائي وأضف بقعة كافية لتغطية الجل. دع الجل يجلس مع تحريك لطيف لمدة 1 ساعة على الأقل < / > ملاحظه: للتحريض ، يمكن وضع حاوية التلوين على أي جهاز يعزز حركة البقعة فوق الجل مع الحفاظ على الجل مغطى بالسائل.
   7. قم بإزالة البقعة من الحاوية واشطف الجل ب dd H₂O. استبدل dd H₂O وانقع الجل لمدة 30 دقيقة بتحريض لطيف. (يجب أن يظهر الجل مثل ما هو موضح في الشكل 2 ، مع فصل واضح لشرائط الهيستون.)
7. قم بتخزين النيوكليوسومات على حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
   ملاحظه: عند تخزينها في هذه الظروف ، تظل النيوكليوسومات مستقرة لعدة أشهر. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.

فئة

2. تصوير AFM بفاصل زمني عالي السرعة لديناميكيات النيوكليوسوم

ملاحظة: يتم توفير البروتوكول أدناه لأداة HS-AFM التي طورتها مجموعة Ando (جامعة كانازاوا ، كانازاوا ، اليابان).

1. تحضير APS-mica للتصوير السائل.
   1. قم بتوصيل القضيب الزجاجي بمرحلة الماسح الضوئي AFM باستخدام غراء الماسح الضوئي للقضيب الزجاجي (انظر جدول المواد). دع هذا يجف لمدة 10 دقائق على الأقل.
   2. اصنع قطعا دائرية بسمك ~ 0.1 مم من الميكا بقطر 1.5 مم عن طريق ثقبها من ورقة ميكا أكبر. استخدم غراء قضيب الميكا الزجاجي HS-AFM (انظر جدول المواد) لربط قطعة الميكا هذه بالقضيب الزجاجي الموجود على HS-AFM وتجفيفها دون أن تمس لمدة 10 دقائق على الأقل. قم بشق الطبقات باستخدام شريط حساس للضغط حتى تظهر طبقة مشقوقة جيدا على الشريط.
   3. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من مخزون 50 ملي مولار APS في 99 ميكرولتر من dd H₂O لعمل محلول 500 ميكرومتر APS. قم بإيداع 2.5 ميكرولتر من هذا المحلول على سطح الميكا المشقوق حديثا واتركه يعمل لمدة 30 ><دقيقة. ملاحظه: لمنع جفاف السطح أثناء العمل ، يمكن تركيب غطاء أنبوب الطرد المركزي المخروطي سعة 50 مل مع قطعة رطبة من ورق الترشيح ووضعه فوق الماسح الضوئي. يتم تخفيف مخزون APS 3 مرات أقل للتصوير السائل مقارنة بالتصوير الثابت للتحكم في الديناميكيات بمعدل يمكن ملاحظته باستخدام AFM.
   4. اشطف الميكا ب 20 ميكرولتر من dd H₂O عن طريق تطبيق عدة ~ 3 ميكرولتر من الشطف. قم بإزالة الماء تماما بعد كل شطف عن طريق وضع منديل غير منسوج على حافة الميكا. بعد الشطف النهائي ، ضع ~ 3 ميكرولتر من dd H₂O على السطح واتركه لمدة 5 دقائق على الأقل لإزالة أي APS غير مرتبط على وجه التحديد.
2. ضع المسبار في حامل HS-AFM وضع الحامل على مرحلة AFM بحيث يكون الطرف متجها لأعلى. اشطف الحامل باستخدام ~ 100 ميكرولتر من dd H₂O متبوعا بشطفتين ~ 100 ميكرولتر من 0.22 ميكرومتر مخزن تصوير النيوكليوسومات المفلترة الذي يحتوي على 10 ملي مولار HEPES ودرجة الحموضة 7.5 و 4 ملي مولار MgCl₂.
3. بعد الانتهاء من الشطف ، املأ الغرفة ب ~ 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتصوير النيوكليوسوم ، وغمر الحافة. اضبط موضع الكابولي حتى يتم ضربه بالليزر. اشطف APS-mica ب 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتصوير النيوكليوسوم المصفى ، باستخدام ~ 4 ميكرولتر لكل شطف.
4. قم بتخفيف 1 ميكرولتر من مخزون تجميع النيوكليوسوم إلى 250 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتصوير النيوكليوسوم المفلتر للحصول على تركيز نهائي للنيوكليوسوم يبلغ 1 نانومتر. ضع 2.5 ميكرولتر من هذا التخفيف على السطح واتركه لمدة دقيقتين. اشطف السطح ب ~ 4 ميكرولتر من مخزن تصوير النيوكليوسوم مرتين. بعد الشطف النهائي ، اترك السطح مغطى في مخزن التصوير. < / > ملاحظه: إذا لم يتم شطف السطح بعد ترسيب عينة النيوكليوسوم ، فسوف يصبح السطح مزدحما بسرعة.
5. اضبط الماسحة الضوئية والعينة أعلى حامل الطرف بحيث تكون العينة مقلوبة لأسفل. لبدء النهج ، استخدم وظيفة الاقتراب التلقائي بسعة نقطة محددة ، A_s قريبة من سعة التذبذب الحرة A₀.
   ملاحظه: من الناحية المثالية ، A_s = 0.95 A₀ ، ومع ذلك ، فإن العمل عند 82٪ من A₀ سيعمل أيضا إذا توخي الحذر.
6. اضبط نقطة الضبط حتى يتم تتبع السطح جيدا.
   ملاحظه: لتقليل نقل الطاقة من طرف AFM إلى عينة النيوكليوسوم ، يجب أن تظل سعة الكابول صغيرة ، مع اتساع منخفض يصل إلى 1 نانومتر الأمثل.
7. اضبط مساحة الصورة حوالي 150 × 150 نانومتر إلى 200 × 200 نانومتر بمعدل الحصول على البيانات ~ 300 مللي ثانية لكل إطار تصوير.
   ملاحظه: عادة ما يكون حجم الصورة هذا كافيا لالتقاط ديناميكيات العديد من النيوكليوسومات في وقت واحد. قد يستدعي السطح الأقل اكتظاظا بالسكان تغييرات على هذه المعلمات. معدل الإطارات المقترح كاف لالتقاط ديناميكيات النيوكليوسوم مثل التكرار والانزلاق وفك التغليف ، من بين أمور أخرى (انظر قسم النتائج التمثيلية أدناه).

< p class = "jove_content" >الجدول 1: الكواشف اللازمة لتجميع النوكليوسوم المستمر لتدرج الملح. يضاف كل مكون من المكونات المدرجة إلى أنبوب الطرد الدقيق الذي يحتوي على الحمض النووي المنقى. يجب أن يتم ذلك بالترتيب الذي يتم به سرد الكواشف في الجدول ، مع إضافة الماء وكلوريد الصوديوم أولا ، متبوعا بثنائي H2A / H2B وإضافة رباعي الهيستون أخيرا. إذا كان سيتم استخدام أوكتامرات هيستون مطوية مسبقا ، فقم بإضافتها بنفس النسبة المستخدمة في رباعي التيترامر أعلاه. * لاحظ محتوى كلوريد الصوديوم في كل مخزون من مخزون هيستون واضبط 5M كلوريد الصوديوم لإضافة وفقا لذلك ، يجب أن يساوي [كلوريد الصوديوم] النهائي 2M. (انظر جدول المواد).

النتائج

الشكل 1: تخطيطي لمضخة الحقنة المستخدمة في تجميع النيوكليوسوم المجهري.يتم وضع خليط التجميع ليكون ملامسا لنهاية إبرة المحقنة. عندما يتم توصيل المخزن المؤقت للتخفيف بواسطة مضخة الحقنة إلى خليط التجميع ، ينخفض تركيز كلوريد الصوديوم ، مما يعزز تجميع النيوكليوسومات. هذا الرقم مقتبس من Stumme-Diers et al.

< p class = "jove_content" >
الشكل 2: S...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات البلازميد pGEM3Z-601 أدجين ، كامبريدج ، ماساتشوستس هاتف: 26656 بادئات PCR IDT ، كورالفيل ، آي إيه طلب مخصص (FP) 5'- CAGTGAATTGTTAATACGACTC-3'
(RP) 5 '-ACAGCTATGACCATGATTAC-3' دريم تك بوليميراز ThermoFischer Scientific ، والثام ، ماساتشوستس برنامج إب 0701 رقم الفهرس ل 200 وحدة طقم تنقية PCR Qiagen ، هيلدن ، ألمانيا هاتف: 28104 رقم الكتالوج ل 50 وحدة قاعدة تريس سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري 10708976001 رقم الفهرس ل 250 جرام EDTA ThermoFischer Scientific ، والثام ، ماساتشوستس 15576028 رقم الفهرس ل 500 جرام (CENP-A / H4)2 ، إنسان مؤتلف إبي سايفر ، دورهام ، نورث كارولاينا 16-0010 رقم الكتالوج ل 50 ug H2A / H2B ، مؤتلف الإنسان إبي سايفر ، دورهام ، نورث كارولاينا 15-0311 رقم الكتالوج ل 50 ug H3 Octamer ، إنسان مؤتلف إبي سايفر ، دورهام ، نورث كارولاينا 16-0001 رقم الكتالوج ل 50 ug طقم جهاز غسيل الكلى Slide-A-Lyzer MINI، 10K MWCO، 0.1 مل ThermoFischer Scientific ، والثام ، ماساتشوستس 69574 رقم الكتالوج ل 10 أجهزة كلوريد الصوديوم سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري S9888-500G رقم الفهرس ل 500 مجم مرشحات الطرد المركزي Amicon Ultra-0.5 مل ميليبور سيجما ، برلنغتون ، ميزوري UFC501008 رقم الكتالوج ل 8 أجهزة حمض الهيدروكلوريك سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري 258148-25 مل رقم الكتالوج ل 25 مل تريسين سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري تي 0377-25 جي رقم الكتالوج ل 25 جم الحزب الديمقراطي الصربي سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري 11667289001 رقم الكتالوج ل 1 كجم بيرسلفات الأمونيوم (AmmPS) بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا هاتف: 1610700 رقم الكتالوج ل 10 جم 30٪ محلول أكريلاميد / مكرر ، 37.5: 1 بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا 1610158 رقم الكتالوج ل 500 مل تيميد بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا هاتف: 1610800 رقم الكتالوج ل 5 مل 4x عينة بروتين Laemmli عازلة ل SDS-PAGE بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا 1610747 رقم الكتالوج ل 10 مل 2-أنا سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري M6250-10 مل رقم الكتالوج ل 10 مل سلم البروتين الملون من PageRuler ThermoFischer Scientific ، والثام ، ماساتشوستس هاتف: 26616 رقم الفهرس ل 500 ميكرولتر صبغة Coomassie الآمنة™ بيولوجيا بيو راد ، هرقل ، كاليفورنيا 1610786 رقم الفهرس ل 1 لتر مناديل غرف الأبحاث غير المنسوجة: TX604 TechniCloth تكس وايب ، كيرنرسفيل ، نورث كارولاينا TX604 موسكوفيت بلوك ميكا آشفيلميكا ، نيوبورت نيوز ، فيرجينيا الصف -1 أمينوبروبيل سيلاتران (APS) تم تصنيعه كما هو موضح في 22 هيبس سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري H4034-25G رقم الكتالوج ل 25 جم سكوتش الشريط سكوتش 3 م ، سانت بول ، مينيسوتا آرون ألفا الصناعية كرازي غراء Toagosei أمريكا ، ويست جيفرسون ، أوهايو AA480 رقم الكتالوج لأنبوب 2 جرام كلوريد المغنيسيوم 2 سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري M8266-100G رقم الفهرس ل 100 جرام مرشح Millex-GP ، 0.22 ميكرومتر سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري SLGP05010 رقم الكتالوج ل 10 أجهزة مسبار BL-AC10DS-A2 AFM (ل HS-AFM) أوليمبوس ، اليابان مركب FG-3020C-20 شركة FluoroTechnology Co.، Ltd. ، Kagiya ، Kasugai ، أيتشي ، اليابان مركب FS-1010S135-0.5 شركة FluoroTechnology Co.، Ltd. ، Kagiya ، Kasugai ، أيتشي ، اليابان الفحص المجهري للقوة الذرية بفاصل زمني عالي السرعة توشيو أندو ، معهد علوم الحياة النانوية ، جامعة كانازاوا ، كاكوما ماتشي ، كانازاوا ، اليابان