$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل المشاركين البشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسي المحلي
< p class = "jove_title" >
1. التثبيت الأولي ، والتثبيت اللاحق ، والتضمين ، والتقسيم ، والتباين
- تحضير 1.6 مل من محلول التثبيت الأولي (2.5٪ جلوتارالديهايد في 0.1 M كاكوديلات الصوديوم (درجة الحموضة 7.3)) في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 2 مل. قم بتخزينه في درجة حرارة 5 درجات مئوية لمدة أقصاها 14 يوما.
- من خزعة العضلات أو العضلات بأكملها ، قم بعزل عينة صغيرة ، يبلغ قطرها الأقصى 1 مم في أي اتجاه وأطول قليلا في اتجاه الألياف الطولية من المقطع العرضي (لأغراض التوجيه).
- ضع العينة في الأنبوب الذي يحتوي على محلول التثبيت الأولي البارد. قم بتخزينه في درجة حرارة 5 درجات مئوية لمدة 24 ساعة.
- اغسل العينة أربع مرات (15 دقيقة بين كل غسلة) في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M (درجة الحموضة 7.3). باستخدام ماصات النقل ، قم بإزالة المخزن المؤقت المستخدم من الأنبوب مع ترك العينة كما هي ، ثم أضف المخزن المؤقت الجديد.
ملاحظه: بعد الغسيل النهائي ، يمكن تخزين العينة في محلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 M عند 5 درجات مئوية لعدة أشهر. يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
- Postfix مع 1٪ رابع أكسيد الأوزميوم (OsO4) و 1.5٪ فيروسيانيد البوتاسيوم (K4Fe (CN) 6) في 0.1 M كاكوديلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.3) لمدة 120 دقيقة عند 4 درجات مئوية
ملاحظه: يعد استخدام 1.5٪ فيروسيانيد البوتاسيوم (K4Fe (CN) 6) ضروريا للتباين الأمثل لجزيئات الجليكوجين.
- اشطفها مرتين بالماء المقطر المزدوج في درجة حرارة الغرفة (RT).
- قم بتجفيف التجفيف عن طريق الغمر في سلسلة متدرجة من الكحول (الإيثانول) عند RT باستخدام التركيزات التالية: 70٪ (10 دقائق) ، 70٪ (10 دقائق) ، 95٪ (10 دقائق) ، 100٪ (10 دقائق) ، و 100٪ (10 دقائق).
ملاحظه: في كل خطوة ، يتم غمر العينة في الإيثانول ، والذي يتم إزالته جزئيا فقط لتجنب تجفيف العينة. أخيرا ، يتم التخلص من بقايا الإيثانول.
- التسلل بمخاليط متدرجة من أكسيد البروبيلين والراتنج الإيبوسيدي في RT باستخدام نسب الحجم التالية (أكسيد البروبيلين / راتنج الإيبوسيديك): 1/0 (10 دقائق) ، 1/0 (10 دقائق) ، 3/1 (45 دقيقة) ، 1/1 (45 دقيقة) ، 1/3 (45 دقيقة) ، 0/1 (بين عشية وضحاها). في اليوم التالي ، قم بتضمين العينات في راتنج إبوسيدي طازج بنسبة 100٪ في قوالب وبلمرة عند 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة.
- قم بقص أقسام رفيعة للغاية (60-70 نانومتر) من الألياف الموجهة طوليا وجمعها على شبكات نحاسية ذات ثقب واحد على النحو التالي.
- قم بتركيب كتلة العينة على حامل الميكروتوم.
- قم بقص الكتلة على السطح بشفرة حلاقة للوصول إلى مستوى الأنسجة.
- قم بتركيب سكين ماسي (قطع فائق 45) أمام العينة وقم بمحاذاة سطح العينة بالتوازي مع السكين.
- أنتج قسما شبه رفيع (1 ميكرومتر) بالسكين الماسي للتحقق من اتجاه العينة. تلطخ القسم شبه الرقيق باللون الأزرق تولويدين للمراقبة باستخدام الفحص المجهري الضوئي.
- قم بقص الكتلة بشكل أكبر لتقليل منطقة الاهتمام من أجل الحصول على أقسام رقيقة للغاية.
- قم بقص أقسام فائقة النحافة (60-70 نانومتر) بسكين ماسي ثان (قطع فائق 45).
- اجمع 1-2 أقسام على شبكات نحاسية ذات ثقب واحد باستخدام حلقة مثالية.
ملاحظه: تحتوي الشبكة النحاسية ذات الفتحة الواحدة على ثقب واحد في المنتصف مع غشاء داعم Formvar.
- تباين الأقسام مع أسيتات اليورانيل وسيترات الرصاص عن طريق غمر الشبكات المذكورة أعلاه في محلول أسيتات اليورانيل (0.5٪ في الماء المقطر المزدوج) لمدة 20 دقيقة ، ثم في محلول سترات الرصاص (1٪ في الماء المقطر المزدوج) لمدة 15 دقيقة. اغسل الشبكات بالماء المقطر المزدوج بين البقعتين وبعدهما.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
< p class = "jove_title" >
2. التصوير
- قم بتشغيل المجهر الإلكتروني للإرسال (يعمل بجهد متسارع يبلغ 80 كيلو فولت) والكمبيوتر وبرنامج تسجيل الصور. سجل الصور الرقمية باستخدام كاميرا CCD رقمية بطيئة 2 ك × 2 كيلو وبرنامج التصوير المرتبط بها.
- أدخل الشبكة بأقسام متعددة في مرحلة المجهر.
- قم بفحص الشبكة في البداية بتكبير منخفض (على سبيل المثال ، x100) لتحديد جودة الأقسام (أي الثقوب الموجودة في الغشاء الداعم ، والحطام ، وما إلى ذلك) واختيار أفضل الأقسام عالية الجودة. عند التكبير المنخفض ، حدد اتجاه ألياف العضلات.
- بعد ذلك ، قم بزيادة التكبير مع تركيز الشعاع على ألياف طرفية في القسم. قم بتركيز الصورة عند التكبير فوق 30 كيلو بايت لضمان تفاصيل دقيقة كافية في الصورة ، مسترشدا بتحويل فورييه السريع في الوقت الفعلي ، إذا كان ذلك متاحا. أخيرا ، سجل الصور بوقت تعريض 1 ثانية بالتكبير المطلوب.
- احصل على ما مجموعه 24 صورة لألياف مختارة عشوائيا ، أي 12 صورة لمساحة اللييفات العضلية و 12 صورة للفضاء تحت الحمامي ، بتكبير يتراوح بين 10 k و 40 k. تأكد من توزيع الصور عبر طول وعرض الألياف بترتيب عشوائي ولكن منهجي للحصول على نتائج غير متحيزة (الشكل 1 أ).
ملاحظه: يعتمد التكبير الأمثل على دقة الكاميرا المتاحة وحجم الصور المجهرية. الهدف هو تحقيق دقة نهائية ، حيث يمكن قياس أقطار جسيمات الجليكوجين في غضون خطوات 1 نانومتر ، وتضمين مساحة إجمالية من منطقة اللييفات العضلية لا تقل عن 70 ميكرومتر2 وطول إجمالي للألياف لا يقل عن 25 ميكرومتر موزعة في 12 صورة لفضاء اللييفات العضلية و 12 صورة للمساحة تحت الحمامية لكل ليف ، على التوالي. من المرجح أن تعطي الصور ال 24 لكل ألياف دقة (معامل خطأ) للمحتوى الحجمي لمجموعات الجليكوجين المختلفة بين 0.1 و 0.2 في الألياف الفردية من عضلات الهيكل العظمي للإنسان والجرذان والفئران (الشكل 2 ه).
- كرر الخطوتين 2.4 و 2.5 حتى يتم تصوير ما مجموعه 6-10 ألياف. إذا لزم الأمر ، قم بقص أقسام إضافية (مفصولة ب 150 ميكرومتر على الأقل لتجنب تداخل الألياف المصورة بالفعل) وكرر الخطوات 1.9-2.5.
3. تحليلات الصور
- قم باستيراد الصور إلى ImageJ بالنقر فوق ملف > فتح.
- اضبط المقياس العام ليتناسب مع الحجم الأصلي للصورة بالنقر فوق تحليل > تعيين المقياس.
- قم بالتكبير بنسبة 100٪ بالنقر فوق الصورة > تكبير > في.
- قم بقياس سمك قرص Z واحد لكل صورة من مساحة اللييفات العضلية (12 لكل ليف) باستخدام أداة Straight Line من قائمة Tools (الشكل 1D). احسب متوسط سمك القرص Z لكل من الألياف 6-10.
- حدد 2-3 ألياف ذات متوسط القرص Z السميك كألياف من النوع 1 و 2-3 ألياف مع أنحف متوسط قرص Z كألياف من النوع 2. تجاهل الألياف الوسيطة 2-4 لمزيد من التحليلات (الشكل 1E).
ملاحظة: تتكرر الخطوات التالية لكل من 4-6 ألياف من العينة. يتم تقدير كسور حجم الجليكوجين عن طريق عد النقاط. يتم اختيار حجم الشبكات للحصول على دقة عالية مرضية للتقديرات. غالبا ما يتم الحصول على ذلك من خلال تحقيق 250 ضربة ، والتي تحدد بعد ذلك العدد الإجمالي للنقاط المطلوبة ، وبالتالي المساحة لكل نقطة.
- استخدم أداة الخط المجزأ لقياس طول اللييفات العضلية الخارجية المرئية أسفل المنطقة تحت الحمامية (الشكل 2 أ).
ملاحظه: يستخدم هذا الطول للتعبير عن الجليكوجين تحت الحمامي لكل مساحة سطح (أي طول اللييفات العضلية الخارجية مضروبا في سمك المقطع (60 نانومتر) ؛ انظر الخطوة 4.5). لذلك ، يتم تضمين المنطقة تحت الحمامية فقط ، والتي يمثلها هذا الطول ، في التحليل.
- أدخل شبكة بالنقر فوق تحليل أدوات > > الشبكة وتعيين المساحة لكل نقطة عند 32,400 نانومتر2. احسب عدد الزيارات ضمن الطول المتاح في 12 صورة تحت الحمامية ، حيث يصطدم الصليب بالجليكوجين تحت الحمامي (الشكل 2 أ). تعرف الضربة بأنها جسيم الجليكوجين الموجود في الزاوية العلوية اليمنى من الصليب.
- أدخل شبكة بالنقر فوق تحليل أدوات > > الشبكة وتعيين المساحة لكل نقطة عند 160,000 نانومتر2. احسب عدد الزيارات في 12 صورة لييفات عضلية ، حيث يصطدم الصليب بالفضاء الليفي الداخلي (الشكل 2 ب).
- أدخل شبكة بالنقر فوق تحليل أدوات > > الشبكة وتعيين المساحة لكل نقطة عند 3,600 نانومتر مربع. احسب عدد الزيارات في 12 صورة لييفات عضلية ، حيث يصطدم الصليب بالجليكوجين الليفي الداخلي (الشكل 2 ج).
- أدخل شبكة بالنقر فوق تحليل أدوات > > الشبكة وتعيين المساحة لكل نقطة عند 32,400 نانومتر2. احسب عدد الزيارات في 12 صورة عضلية ، حيث يصطدم الصليب بالجليكوجين بين اللييفات العضلية (الشكل 2 د).
- باستخدام أداة الخط المستقيم ، قم بقياس قطر خمسة جزيئات جليكوجين تم اختيارها عشوائيا لكل تجمع لكل صورة من الصور ال 12 للحصول على ما معدله 60 جسيما لكل تجمع لكل ألياف.
ملاحظة: يغطي متوسط 60 جسيما إلى حد كبير التباين داخل الألياف (الشكل 2F).
