القياس الكمي لتكوين الكشكشة الغشائية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح

الملخص

المصدر: Ahn ، W. et al. ، تصور تكوين كشكشة الغشاء باستخدام الفحص المجهري الإلكتروني الماسح.J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو تحضير العينة وتثبيتها وتصوير خلية البلاعم التي تعرض الكشكشة الغشائية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح ، SEM. تعد المعلومات التفصيلية حول مورفولوجيا الغشاء وتنظيمه أمرا بالغ الأهمية لفهم الحالة الفسيولوجية للخلايا.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. خط الخلية وزراعة الخلايا

1. قم بزراعة 264.7 وحدة بلاعم خام في وسط النسر المعدل (DMEM) من Dulbecco مع 10٪ (حجم / حجم) مصل بقري الجنين المعطل بالحرارة (FBS) ، و 100 وحدة دولية / مل من البنسلين و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. استبدل وسائط النمو كل يومين.
2. عندما تصبح الخلايا ملتصقة بنسبة 80٪ ، اغسل اللوحة مرتين باستخدام PBS المعقم.
3. افصل الخلايا عن طريق إضافة 1,000 ميكرولتر من 0.5٪ تريبسين-EDTA واحتضان لوحة زراعة الخلايا لمدة 3-5 دقائق في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية.
4. افحص اللوحة تحت المجهر الضوئي لتأكيد تفكك الخلية. أضف 10 مل من وسائط النمو التي تحتوي على 10٪ FBS لتعطيل التربسين.
5. اجمع معلق الخلية في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا برفق في وسط زراعة الخلايا الكامل وحدد عدد الخلايا وقابليتها للحياة باستخدام تلطيخ Trypan Blue (0.4٪.
   ملاحظه: الحد الأدنى الموصى به لصلاحية الخلية لهذه التجربة هو >90٪.
6. ضع أغطية زجاجية معقمة في آبار صفيحة 24 بئرا باستخدام ملقط معقم. خلايا البذور على أغطية بكثافة 1 × 10⁶ خلايا / مل واحتضان اللوحة طوال الليل في حاضنة رطبة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
7. قم بتغيير وسائط كل بئر بوسائط كاملة جديدة سعة 500 ميكرولتر قبل المعالجة. المعالجة المسبقة للبلاعم بالمركبة (DMSO أو المذيبات الأخرى المستخدمة لإذابة EIPA) أو مثبط كثرة الخلايا الكبيرة 5- (N-ethyl-N-isopropyl) -Amiloride (EEPA ، 25 ميكرومتر) لمدة 30 دقيقة.
8. عالج الخلايا بالمركبة ومحفزات كثرة الخلايا الكبيرة لتعزيز تكسير الغشاء: فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA ، 1 ميكرومتر ، 30 دقيقة) وعامل تحفيز مستعمرة البلاعم (M-CSF ، 100 نانوغرام / مل ، 30 دقيقة).
   ملاحظه: يمكن أيضا استخدام المثبطات البديلة [على سبيل المثال ، لاترونكولين أ (1 ميكرومتر ، 30 دقيقة) أو السيتوكالاسين D (1 ميكرومتر ، 30 دقيقة)] والمنشطات [على سبيل المثال ، عامل نمو البشرة (EGF ، 100 نانوغرام / مل ، 10 دقائق) أو عامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF ، 100 نانوغرام / مل ، 15 دقيقة)] لكثرة الخلايا الكبيرة لتوصيف كثرة الخلايا الكبيرة في البلاعم وأنواع الخلايا الأخرى. قد تتطلب الخلايا تجويعا في المصل طوال الليل قبل العلاج بالمحفزات الفسيولوجية لكثرة الكريات الكبيرة. من المهم ملاحظة أنه يجب تحديد التركيزات وأوقات الحضانة الأكثر فعالية لتحفيز كثرة الخلايا الكبيرة في أنواع الخلايا الأخرى.

2. تثبيت SEM

1. بعد العلاج ، قم بشفط الوسائط من الآبار واغسل الأغطية باستخدام PBS المثلج مرتين.
2. قم بإصلاح الخلايا (4٪ بارافورمالدهيد و 2٪ جلوتارالديهايد في 0.1 M من الكاكوديلات الصوديوم) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، تليها حضانة ليلية في المثبت عند 4 درجات مئوية.
3. اغسل الغطاء واحتضانه برفق باستخدام 500 ميكرولتر من الكواشف التالية دون إزعاج طبقة أحادية الخلية.
   1. يغسل مرة واحدة في 0.1 م من كاكوديلات الصوديوم ويحتضن لمدة 15 دقيقة.
   2. يغسل مرتين باستخدام dH₂O مع حضانة لمدة 10 دقائق في كل غسلة.
   3. يغسل مرتين باستخدام 25٪ إيثانول مع 10 دقائق من الحضانة في كل غسلة.
   4. يغسل مرتين باستخدام 50٪ إيثانول مع 10 دقائق من الحضانة في كل غسلة.
   5. يغسل مرتين باستخدام 75٪ من الإيثانول مع 10 دقائق من الحضانة في كل غسلة.
   6. يغسل مرتين باستخدام 80٪ من الإيثانول مع 10 دقائق من الحضانة في كل غسلة.
   7. يغسل مرتين باستخدام 95٪ إيثانول مع 10 دقائق من الحضانة في كل غسلة.
   8. يغسل مرتين بالإيثانول 100٪. قم بإجراء 10 دقائق من الحضانة في كل غسلة.
      ملاحظه: يجب أن يتم تغيير / استبدال الكواشف بسرعة لمنع جفاف الخلايا بالهواء. يمكن ترك الغطاء في الإيثانول بنسبة 100٪ لعدة أيام عند 4 درجات مئوية. للتخزين طويل الأجل ، أضف الإيثانول الإضافي بنسبة 100٪ وقم بتغطية الآبار بالبارافيلم لمنع تجفيف العينة بالهواء

< p class = "jove_title" >3. تجفيف النقطة الحرجة

1. ضع أغطية في مجفف النقطة الحرجة وقم بتغطيتها بالإيثانول بنسبة 100٪. اضغط على زر الطاقة وافتح خزان ثاني أكسيد الكربون₂.
2. اضغط على الزر Cool لمدة 30 ثانية تقريبا حتى تنخفض درجة الحرارة إلى 0 درجة مئوية. اضغط على زر Fill حتى تظهر فقاعة في نافذة الغرفة.
3. اضغط على زر التطهير حتى تختفي رائحة الإيثانول من عادم التطهير. اضغط على الزر "تبريد" مرة أخرى حتى تنخفض درجة الحرارة إلى 0 درجة مئوية.
4. اضغط على أزرار التعبئة والتطهير لإيقاف تشغيلها وإغلاق خزان ثاني أكسيد الكربون₂. اضغط على زر التبريد لإيقاف تشغيله واضغط على زر الحرارة.
5. اضبط درجة الحرارة على 42 درجة مئوية والضغط عند 1,200 رطل لكل بوصة مربعة. بمجرد استقرار الضغط ودرجة الحرارة ، اضغط على زر النزيف للسماح للضغط بالانخفاض ببطء.
6. بمجرد أن يصل ضغط الغرفة إلى 150 رطل لكل بوصة مربعة ، اضغط على زر التهوية وانتظر حتى ينخفض الضغط إلى 0 رطل لكل بوصة مربعة. قم بإيقاف تشغيل مجفف النقطة الحرجة وإزالة الغطاء.
7. قم بتركيب أغطية على حوامل عينة من الألومنيوم SEM باستخدام علامات تبويب لاصقة للكربون وتخضع لطلاء الرش باستخدام الذهب / البلاديوم في طلاء الرش.
8. قم بتشغيل زر الطاقة وانتظر حتى يصل المكنسة الكهربائية إلى 30 mTorr. اغسل الغرفة لإزالة الرطوبة والهواء عن طريق إيقاف تشغيل مفتاح الغاز وتدوير صمام الغاز الناعم عكس اتجاه عقارب الساعة.
9. بمجرد زيادة الفراغ إلى 200 mTorr ، قم بإيقاف تشغيل مفتاح الغاز وانتظر حتى يصل الفراغ إلى 30 mTorr. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
10. اضغط على زر المؤقت واضبط مقبض الجهد حتى يقرأ المقياس 10 مللي أمبير. قم بإزالة أغطية المغلفة من الغرفة.
    ملاحظه: اتبع تعليمات الشركة المصنعة لإجراء تجفيف النقاط الحرجة وطلاء الرش للعينة.

< p class = "jove_title" >4. التصوير والقياس الكمي

1. أدخل أغطية العينة في حجرة المجهر الإلكتروني الماسح. أغلق الباب واضغط على زر Evac.
2. افتح برنامج تشغيل SEM. اضبط الجهد المتسارع على 15 كيلو فولت ومسافة العمل على 10 مم.
3. اضغط على زر الإحداثيات وتحرك حول وحدة التحكم حتى تظهر الخلايا في وسط شاشة المراقبة. اضبط التكبير على 3,500x وقم بتصوير العينة بالنقر فوق الزر صورة.
   ملاحظه: استخدم مستوى أعلى من التكبير (8,500x إلى 16,000x) لإظهار غشاء البلازما بمزيد من التفاصيل.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 0.5٪ تريبسين EDTA جيبكو 15400-054 2٪ جلوتارالديهايد علوم المجهر الإلكتروني 16320 [ا] 4٪ بارافورمالديهايد سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية 281692 5- (N-ethyl-N-isopropyl) -Amiloride سيجما لايف ساينس أ 3085 علامات تبويب لاصقة الكربون علوم المجهر الإلكتروني 77825-09 ثنائي ميثيل سلفوكسيد كورنينج 25-950-CQC وسط النسر المعدل من Dulbecco سيتيفا لعلوم الحياة SH30022.01 Falcon 24-well Clear Flat Bottom معالج TC لوحة ثقافة الخلايا متعددة الآبار صقر 353047 مصل الأبقار الجنينية الجوزاء بيو 900-108 حاضنة HERAcell 150i CO2 ثيرمو فيشر العلمي 51026282 هامر موديل 6.2 الاخرق المغطي Anatech الولايات المتحدة الأمريكية 58565 JSM-IT500HR المجهر الإلكتروني الماسح زجاج غطاء المجهر ثيرمو فيشر العلمي 12-545-82 القلم Strep جيبكو 15140-122 فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات ميليبور سيجما 524400 RAW 264.7 البلاعم ATCC ATCC TIB-71 M-CSF البشري المؤتلف بيبروتك 300-25 Samdri-790 مجفف النقاط الحرجة شركة توسيميس للأبحاث 8778 ب SEM عينة الألومنيوم يتصاعد علوم المجهر الإلكتروني 75220 كاكوديلات الصوديوم علوم المجهر الإلكتروني 12300 ريال تريبان بلو سوليشن ثيرمو فيشر العلمي 15250061