مقالة منهجية

الفحص المجهري المناعي الفلوري لتحليل فواصل الحمض النووي المزدوجة

يوليو 8, 2025

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_content" >المصدر: Popp ، H. D. ، وآخرون. الفحص المجهري المناعي ل γH2AX و 53BP1 لتحليل تكوين وإصلاح فواصل الحمض النووي المزدوجة. J. Vis. Exp. (2017)

في هذا الفيديو ، نصف تقنية الفحص المجهري المناعي الفلوري للكشف عن بروتينات استجابة تلف الحمض النووي المحددة في مواقع فواصل الحمض النووي المزدوجة في الخلايا البشرية أحادية النواة. يتم التعرف على البروتينات بواسطة أجسام مضادة أولية محددة ، والتي بدورها ترتبط بالأجسام المضادة الثانوية الموسومة بالفلوروفور والتي تتألق أثناء التصور المجهري ، مما يتيح تصور البروتينات كبؤر فلورية مميزة داخل نوى الخلية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير الحلقات الخلوية

  1. قم بإعداد اثنين من الدوران الخلوي مع خلايا أحادية النواة لعينات المريض (على سبيل المثال ، واحد سيتوبين لتلوين التألق المناعي γH2AX وواحد سيتوبين ل γH2AX و 53BP1 تلطيخ التألق المناعي المشترك) عن طريق الطرد المركزي (300 × جم ، 10 دقائق) من 1.0 × 105 خلايا لكل مستحضر (الشكل 1 و 2).
فئة

2. γH2AX و 53BP1 تلطيخ التألق المناعي

  1. التثبيت والنفاذية: قم بإصلاح الخلايا ب 200 ميكرولتر من 4٪ PFA لمدة 10 دقائق. بعد التثبيت ، اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من PBS لمدة 5 دقائق لكل منها على شاكر المختبر. ثم تخلل الخلايا ب 200 ميكرولتر من 0.1٪ أوتوكسينول 9 لمدة 10 دقائق. اغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من محلول مانع 5٪ لمدة 5 دقائق لكل منها على شاكر المختبر. قم بسد الخلايا في 30 مل من محلول حجب طازج بنسبة 5٪ لمدة ساعة واحدة.
  2. حضانة الأجسام المضادة
    1. احتضان مستحضر واحد من الخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر (1: 500) والمستحضر الآخر للخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفأر (1: 500) وجسم مضاد للأرنب متعدد النسيلة مضاد ل 53BP1 (1: 500) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية.
    2. بعد الحضانة ، اغسل الخلايا برفق 3 مرات باستخدام 30 مل من محلول مانع 2٪ لكل 5 دقائق على شاكر المختبر.
    3. قم بإزالة محلول المنع واحتضان المستحضر الأول للخلايا بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر من الماعز المترافق Alexa488 (1: 500) والتحضير الثاني للخلايا بجسم مضاد ثانوي مضاد للفأر من الماعز المترافق Alexa488 (1: 500) وجسم مضاد ثانوي مضاد للأرانب من الحمار المترافق Alexa555 (1: 500) لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
  3. وسط التركيب: ضع الشريحة مع الخلايا في وعاء واغسل الخلايا برفق ثلاث مرات باستخدام 30 مل من PBS لكل 5 دقائق على شاكر المختبر. قم بإزالة PBS وقم بتركيب الخلايا بوسيط تركيب يحتوي على 4،6-diamidino-2-phenylindole. ضع غطاء بحذر فوق وسط التثبيت حتى لا يتم تضمين فقاعات هواء. انتظر لمدة 3 ساعات على الأقل لتصلب وسط التركيب قبل تحليل الخلايا عن طريق الفحص المجهري الفلوري.
فئة

3. تحليل بؤر γH2AX و 53BP1

  1. الفحص المجهري الفلوري: قم بتحليل بؤر γH2AX و 53BP1 في نوى الخلية باستخدام مجهر مضان مزود بمرشحات ل DAPI و Alexa 488 و Cy3 أثناء التصوير بتكبير موضوعي 100X. سجل الصور بالكاميرا وقم بمعالجة الصور باستخدام برنامج التصوير المناسب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

p class = "jove_content" >figure-results-1
الشكل 1: جهاز لتحضير السيتوبينسبين.

figure-results-2
الشكل 2: تحضير العصائر الخلوية. يتم تحضير اثنين من الدوران الخلوي لكل عينة عن طريق الطرد المركزي 1.0 × 105 خلايا عند 300 × جم لمدة 10 دقائق. يتم استخدام سيتوبين واحد لتلوين التألق المناعي γH2AX ، ويتم استخدام سيتوبين آخر لتلوين التألق المناعي γH2AX و 53BP...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
لم يتم الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات شرائح المجهر التشخيصي الترمو: العلمية ER-203B-CE24 شرائح المجهر ميجافوجج 1.0 ص هيريوس 75003060 جهاز طرد مركزي منضدية جهاز Cytospin غطاء هيريوس 76003422 غطاء للعمل بدون أنابيب صغيرة حاوية Cyto هيريوس 75003416 حاوية Cyto مع 2 تجاويف مخروطية الشكل حامل المقطع هيريوس 75003414 حامل لحمل حاوية سيتو وشريحة إدراج الدعم هيريوس 75003417 إدراج الدعم لحمل حامل المشبك بارافورمالدهيد سيجما ألدريتش ص 6148 عامل التثبيت محلول ملحي مخزن بالفوسفات سيجما ألدريتش د8537 محلول ملح متوازن مانع كيميائي ميرك ميليبور 2170 عامل الحظر الجسم المضاد أحادي النسيلة للفأر المضاد ل γH2AX (JBW301) ميرك ميليبور 05-636 الجسم المضاد الأولي للكشف عن γH2AX أجسام مضادة للأرانب متعددة النسيلة مضادة ل 53BP1 (NB100-304) نوفوس بيولوجيكس NB100-304 الجسم المضاد الأولي للكشف عن 53BP1 Alexa Fluor 488 الجسم المضاد للماعز المترافق المضاد للفأر إنفيتروجين أ -11001 الجسم المضاد الثانوي Alexa Fluor 555 مترافق الحمار المضاد للأرانب إنفيتروجين أ -31572 الجسم المضاد الثانوي Vectashield تركيب الوسط مختبرات ناقلات إتش-1200 يحتوي على DAPI لتلوين الحمض النووي نطاق أكسيو.A1 زييس 490035 المجهر الفلوري كاميرا Cool Cube 1 CCD النظم الفوقية H-0310-010-MS نظام الكاميرا للتسجيل الرقمي برنامج إيزيس النظم الفوقية لا ينطبق برنامج المجهر

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

H2AX 53BP1 DAPI

مقالات ذات صلة