$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. إنتاج 15نيوتن ، 13C-Tau (الشكل 1)
- أتشكيل pET15b-Tau بلازميد التعبير المؤتلف T7 في خلايا بكتيرية الإشريكية القولونية المختصة BL21 (DE3.
ملاحظة: يتم استنساخ ترميز (كدنا) لأطول (441 بقايا من بقايا الأحماض الأمينية) الشكل الإسوي Tau بين مواقع تقييد NcoI و XhoI في بلازميد pET15b.
- امزج بلطف 50 ميكرولتر من خلايا BL21 (DE3) المختصة ، لتشكيل 1-5 × 107 مستعمرات لكل ميكروغرام من الحمض النووي البلازميد ، مع 100 نانوغرام من الحمض النووي البلازميد في أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مل><.
ملاحظه: السلالات البكتيرية المحسنة لاستخدام الكودون لتعبير الحمض النووي (كدنا) حقيقيات النواة ليست ضرورية لإنتاج تاو البشري.
- ضع خليط الخلية على الثلج لمدة 30 دقيقة ثم صدمة حرارية لمدة 10 ثوان عند 42 درجة مئوية. ضع الأنبوب مرة أخرى على الثلج لمدة 5 دقائق وأضف 1 مل من درجة حرارة الغرفة LB (Luria-Bertani) المتوسط. احتضان المعلق البكتيري عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة تحت تحريض لطيف.
- يوزع باستخدام حلقة تلقيح 100 ميكرولتر من معلق الخلية بالتساوي على صفيحة أجار من وسط LB يحتوي على 100 ميكروغرام / مل من المضادات الحيوية الأمبيسلين.
- احتضان لوحة الاختيار لمدة 15 ساعة عند 37 درجة مئوية.
- احتفظ بلوحة الاختيار عند 4 درجات مئوية حتى الانتقال إلى خطوة الاستزراع ، لمدة أقصاها 2 أسابيع تقريبا.
ملاحظة: يمكن تحضير مخزون الجلسرين من المزرعة البكتيرية (50٪ جلسرين) ، المخزن عند -80 درجة مئوية ، لبدء الزراعة في مرحلة لاحقة.
- أضف 1 مل 1 م MgSO4 ، 1 مل 100 ملي CaCl2 ، 10 مل 100x مكمل فيتامين MEM ، 1 مل 100 مجم / مل أمبيسلين إلى 1 لتر من أملاح M9 المعقمة (6 جم Na2HPO4 ، 3 جم KH2PO4 ، 0.5 جم كلوريد الصوديوم). < / >
ملاحظه: سوف يتشكل راسب أبيض عند إضافة محلول CaCl2 إلى أملاح M9 التي تتبدد بسرعة.
- قم بإذابة 300 مجم من 15نيوتن ، و 13درجة مئوية كاملة ، و 1 جم من 15NH4Cl ، و 2 جم من 13C 6-glucose في 10 مل من وسط M9. قم بتعقيم محلول النظائر باستخدام مرشح 0.2 ميكرومتر ، مباشرة في وسط M9.
- تعليق باستخدام حلقة تلقيح مستعمرة واحدة من pET15b-Tau تحولت البكتيريا من لوحة الاختيار في 20 مل من وسط LB مكمل ب 100 ميكروغرام / مل من الأمبيسلين.
- احتضان الوسط الملقح عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات تقريبا.
- قم بقياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD600) على 1 مل من تخفيف عشرة أضعاف للثقافة البكتيرية في مطياف بلاستيكي cuvette.
ملاحظه: تشير تعكارة الثقافة البكتيرية المقابلة ل OD600 من 3.0-4.0 إلى الوصول إلى مرحلة نمو التشبع.
- أضف 20 مل من مزرعة LB المشبعة إلى 1 لتر من وسط النمو M9 المكمل بالأمبيسلين (التركيز النهائي 100 ميكروغرام / مل) ، في قارورة استزراع بلاستيكية محيرة سعة 2 لتر من Erlenmeyer.
- ضع قارورة الاستزراع في حاضنة قابلة للبرمجة مضبوطة على 10 درجات مئوية و 50 دورة في الدقيقة. قم ببرمجة الحاضنة للتبديل إلى 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية في وقت مبكر من صباح اليوم التالي.
- قم بقياسOD 600 على 1 مل من المزرعة البكتيرية في كوفيت مطياف بلاستيكي. أضف 400 ميكرولتر من محلول مخزون 1 M IPTG (الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside) (يحفظ عند -20 درجة مئوية) عندما يصل OD600 إلى قيمة حوالي 1.0 للحث على التعبير عن بروتين تاو المؤتلف.
- استمر في الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 3 ساعات أخرى. اجمع الخلايا البكتيرية عن طريق الطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 20 دقيقة.
- قم بتجميد الحبيبات البكتيرية عند -20 درجة مئوية. يحفظ مجمدا حتى خطوة التنقية لفترة طويلة إذا لزم الأمر.
< p class = "jove_title" >
2. تنقية 15N ، 13C-Tau (الشكل 2)
- مخازن تنقية التبادل الكاتيوني للأوتوكلاف (CEX) عند 121 درجة مئوية تحت 15 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 20 دقيقة.
- قم بإذابة حبيبات الخلية البكتيرية وإعادة تعليقها جيدا في 45 مل من المخزن المؤقت CEX A (50 ملي مولار NaPi المخزن المؤقت 6.5 ، 1 ملي مولار EDTA) مكمل حديثا بكوكتيل مثبط الإنزيم البروتيني 1x (1 قرص) و DNAseI (2,000 وحدة).
- قم بتعطيل الخلايا البكتيرية باستخدام الخالط عالي الضغط عند 20,000 رطل لكل بوصة مربعة. جهاز طرد مركزي عند 20،000 × جم لمدة 40 دقيقة لإزالة المواد غير القابلة للذوبان.
- سخني مستخلص الخلية البكتيرية لمدة 15 دقيقة عند 75 درجة مئوية باستخدام حمام مائي.
ملاحظة: لوحظ راسب أبيض بعد بضع دقائق.
- جهاز طرد مركزي عند 15,000 × جم لمدة 20 دقيقة والحفاظ على المادة الطافية التي تحتوي على بروتين تاو المستقر للحرارة.
- يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية حتى خطوة التنقية التالية إذا لزم الأمر.
- قم بإجراء كروماتوغرافيا التبادل الكاتيوني على راتنج CEX قوي معبأ كعمود سرير سعة 5 مل باستخدام نظام كروماتوغرافيا سائل البروتين السريع (FPLC) (الشكل 3 أ).
- اضبط معدل التدفق على 2.5 مل / دقيقة.
- موازنة العمود في المخزن المؤقت CEX A
- قم بتحميل المستخلص الساخن 60-70 مل الذي يحتوي على تاو باستخدام مضخة عينة ، أو بدلا من ذلك قم بضخ A ، اعتمادا على النظام. اجمع التدفق للتحليل للتحقق من ارتباط بروتين تاو بكفاءة بالراتنج (انظر 2.8).
- اغسل الراتنج باستخدام المخزن المؤقت CEX A حتى يعود الامتصاص عند 280 نانومتر إلى القيمة الأساسية.
- قم بإخراج تاو من العمود باستخدام تدرج كلوريد الصوديوم المكون من ثلاث خطوات تم الحصول عليه عن طريق الزيادة التدريجية للمخزن المؤقت CEX B (المخزن المؤقت CEX A مع 1 M كلوريد الصوديوم). قم ببرمجة FPLC على النحو التالي: الخطوة الأولى من التدرج إلى 25٪ CEX B buffer في 10 أحجام أعمدة (CV) للوصول إلى 250 ملي كلوريد الصوديوم ، والخطوة الثانية إلى 50٪ CEX B في 5 CV للوصول إلى 500 ملي كلوريد الصوديوم ، والخطوة الثالثة إلى 100٪ CEX B buffer في 2 CV للوصول إلى 1 M كلوريد الصوديوم. اجمع 1.5 مل من الكسور أثناء خطوات الشطف.
- قم بتحليل 10 ميكرولتر من الكسور التي تم جمعها أثناء خطوة الشطف بواسطة SDS-PAGE (12٪ جل SDS-acrylamide) وتلوين Coomassie (الشكل 3 أ). تحقق من خطوة التحميل على العمود أيضا من خلال تحليل 10 ميكرولتر من التدفق.
- اختر الكسور التي تحتوي على تاو وقم بتجميع هذه الكسور للخطوة التالية.
- قم بإجراء تبادل مخزن مؤقت على الكسور المجمعة المحتوية على Tau (الشكل 3 ب).
- قم بموازنة عمود تحلية المياه المكون من سرير معبأ بالراتنج G25 سعة 53 مل (26 × 10 سم) في بيكربونات الأمونيوم 50 ملي مولار (عازلة متطايرة) باستخدام نظام FPLC.
- اضبط معدل التدفق على 5 مل / دقيقة. قم بحقن عينة Tau على العمود عبر حلقة حقن 5 مل. اجمع الكسور المقابلة لذروة الامتصاص عند 280 نانومتر.
- كرر الحقن 3-4 مرات ، اعتمادا على حجم تجمع CEX الأولي.
- احسب كمية بروتين تاو المنقى باستخدام مساحة الذروة للكروماتوجرام عند 280 نانومتر (1 مجم من تاو يتوافق مع 140 مللي أمبير * مل).
ملاحظه: معامل انقراض بروتين تاو عند 280 نانومتر هو 7،550 م -1سم -1. لا يحتوي تاو على أي بقايا Trp.
- تجمع جميع كسور تاو.
قم - بتقسيم العينة إلى أنابيب تحتوي على ما يعادل 1 إلى 5 مجم من تاو. اختر هذه الأنابيب بحيث يكون حجم المحلول صغيرا مقارنة بحجم الأنبوب (على سبيل المثال 5 مل من المحلول في أنبوب سعة 50 مل).
- قم بعمل ثقوب في أغطية الأنبوب باستخدام إبرة. قم بتجميد عينات تاو عند -80 درجة مئوية.
- عينات تاو المجفد. يمكن الاحتفاظ ببروتين تاو المجفف بالتجميد عند -20 درجة مئوية لفترات طويلة من الزمن.
< p class = "jove_title" >
3. الفسفرة في المختبر ل 15N-Tau
- قم بإذابة 5 مجم من تاو المجفف بالتجميد في 500 ميكرولتر من محلول الفسفرة (50 ملي مولار Hepes · KOH ، درجة الحموضة 8.0 ، 12.5 ملي ملي MgCl2 ، 1 ملي EDTA ، 50 ملي كلوريد الصوديوم).
- أضف 2.5 ملي مولار ATP (25 ميكرولتر من محلول مخزون 100 ملي يتم الاحتفاظ به عند -20 درجة مئوية) ، 1 ملي مولار DTT (1 ميكرولتر من محلول مخزون 1 متر محفوظ عند -20 درجة مئوية) ، 1 ملي مولار EGTA (2 ميكرولتر من محلول مخزون 0.5 متر) ، 1 × كوكتيل مثبط للبروتياز (25 ميكرولتر من مخزون 40x تم الحصول عليه عن طريق إذابة قرص واحد في 1 مل مخزن مؤقت للفسفرة) و 1 ميكرومتر منشط His-ERK2 (250 ميكرولتر في المخزن المؤقت للحفظ 10 ملي مولار Hepes ، درجة الحموضة 7.3 ، 1 ملي مولار DTT ، 5 ملي مولار كلوريدالصوديوم 2 ، 100 ملي كلوريد الصوديوم و 10٪ جلسرين ، مخزنة عند -80 درجة مئوية) في حجم عينة إجمالي قدره 1 مل
ملاحظه: يمكن تحضير His-ERK2 المنشط داخليا عن طريق الفسفرة باستخدام كيناز مجاهدي خلق.
- احتضان 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
- سخني العينة عند 75 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتعطيل كيناز ERK.
- جهاز طرد مركزي عند 20,000 × جم لمدة 15 دقيقة.
- قم بتحلية عينة البروتين إلى 50 ملي مولار بيكربونات الأمونيوم باستخدام عمود من 3.45 مل G25 سرير معبأ بالراتنج (1.3 × 2.6 سم) ، وهو مناسب لعينة 1 مل.
- قم بتشغيل SDS-PAGE بنسبة 12٪ مع 2.5 ميكرولتر من عينة البروتين للتحقق من سلامتها وفسفرتها الفعالة (الشكل 4).
- قم بتجميد عينة تاو الفسفرية. قم بتخزين المسحوق عند -20 درجة مئوية.
< p class = "jove_title" >
4. الاستحواذ على أطياف الرنين المغناطيسي النووي (الشكل 5)
- إذابة 4 ملغ من 15نيوتن ، 13درجة مئوية من ERK - فسفرة تاو في 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت للرنين المغناطيسي النووي (50 ملي NaPi أو 50 ملي مولار Tris-d11 المنظوف. Cl ، درجة الحموضة 6.5 ، 30 ملي كلوريد الصوديوم ، 2.5 ملي EDTA ، و 1 ملي مولار DTT).
- أضف 5٪ D2O لقفل المجال لمطياف الرنين المغناطيسي النووي و 1 ملي مولار TMSP (3- (ثلاثي ميثيل سيليل) بروبيونيك-2،2،3،3-د4 ملح الصوديوم الحمضي)) كمرجع إشارة داخلي للرنين المغناطيسي النووي. أضف 10 ميكرولتر من محلول مخزون 40x من كوكتيل مثبط البروتياز الكامل.
- انقل العينة إلى أنبوب الرنين المغناطيسي النووي مقاس 5 مم باستخدام حقنة إلكترونية بإبرة طويلة أو ماصة باستور. أغلق أنبوب الرنين المغناطيسي النووي باستخدام المكبس. قم بإزالة أي فقاعات هواء محاصرة بين المكبس والسائل عن طريق حركات المكبس.
- ضع أنبوب الرنين المغناطيسي النووي في دوار. اضبط موضعه الرأسي في الدوار باستخدام المقياس المناسب لرأس مسبار الرنين المغناطيسي النووي المستخدم ، بحيث يكون معظم محلول العينة داخل ملف الرنين المغناطيسي النووي.
- بدء تدفق الهواء: انقر فوق الرفع في نافذة نظام التحكم في المغناطيس. ضع الدوار بحذر مع الأنبوب في تدفق الهواء في الجزء العلوي من تجويف المغناطيس. أوقف تدفق الهواء (انقر فوق الرفع) واترك الأنبوب ينزل في مكانه داخل رأس المسبار في المغناطيس.
- اضبط درجة الحرارة على 25 درجة مئوية (298 كلفن).
- قم بإجراء ضبط ومطابقة شبه أوتوماتيكي لرأس المسبار لتحسين نقل الطاقة. اكتب atmm في سطر الأوامر.
- قم بقفل تردد مقياس الطيف باستخدام إشارة D2O للعينة المسجلة على قناة الديوتيريوم. انقر فوق قفل في نافذة نظام التحكم في المغناطيس.
- ابدأ إجراء التقطيع لتحسين تجانس المجال المغناطيسي في موضع العينة. اكتب واجهة المستخدم الرسومية topshim في سطر الأوامر لفتح نافذة الرقائق. انقر فوق البدء في نافذة الرقائق. تحقق من قيمة التباين القياسي B0 المتبقية للتحقق من أن الحشوات مثالية (أقل من 2 هرتز جيد).
- معايرة المعلمة p1 (طول نبضة الترددات الراديوية للبروتون في ميكرو ثانية) ، وهو أمر ضروري للحصول على دوران 90 درجة لدوران البروتون. استهدف النبضة 360 درجة باستخدام طيف 1D من بروتونات الماء (الشكل 6).
- اضبط إزاحة التردد عن طريق ضبط المعلمة o1 (بالهرتز) على تردد ماء البروتون في الطيف 1D (الشكل 6).
- ابدأ في الحصول على طيف البروتون 1D (تسلسل النبض مع تسلسل ووترغيت لقمع إشارة المياه ، على سبيل المثال ، zggpw5) للتحقق من الإشارات من العينة (الشكل 7). تكييف عدد عمليات المسح مع تركيز البروتين النسبي. اكتب zg في سطر الأوامر لبدء الاستحواذ.
