تقنية التحليل الطيفي لثنائي اللون الدائري لدراسة تفاعلات الحمض النووي والبروتين

الملخص

المصدر: Arya, V., et al. التحليل الطيفي للقرص المضغوط لدراسة تفاعلات الحمض النووي والبروتين. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو تقنية التحليل الطيفي لثنائي اللون الدائري (CD) لدراسة التغيرات التوافقية التي تحدث في الحمض النووي في وجود بروتين إعادة تشكيل الكروماتين المعتمد على ATP. تشير التغييرات في أطياف القرص المضغوط المقاسة في وجود وعدم وجود التحلل المائي ل ATP إلى أهمية ATP في قدرة المعاد تشكيله على إحداث تغييرات توافقية في الحمض النووي المرتبط.

البروتوكول

ص الفئة = "jove_title" >1. تركيز العمل لمكونات التفاعل

1. قم بإعداد تركيزات العمل من المخازن المؤقتة للقرص المضغوط حديثا واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية قبل إعداد التفاعلات.
   ملاحظه: بالنسبة لتفاعلات القرص المضغوط الموصوفة في هذه الورقة ، فإن تركيزات عمل المكونات هي كما يلي: مخزن فوسفات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.0) 1 ملي مولار ، ATP 2 ملي مولار ، الحمض النووي 500 نانومتر ، البروتين 1 ميكرومتر ، MgCl₂ 10 ملي ، EDTA 50 ملي مولار ، ADAADiN 5 ميكرومتر.

2. اختيار وإعداد كوفيت الأقراص المضغوطة

1. اجمع أطياف الأقراص المضغوطة في كوفيتز كوارتز عالي الشفافية. استخدم كوفيت مستطيل أو أسطواني.
   ملاحظه: تم استخدام كوفيت كوارتز CD (الحجم الاسمي 0.4 مل ، طول المسار 1 مم) لجميع التفاعلات الموضحة في هذه الورقة.
2. استخدم محلول تنظيف الكوفيت لتنظيف الكوفيت. أضف محلول تنظيف الكوفيت 1٪ في الماء لعمل 400 ميكرولتر من المحلول ، واسكبه في الكوفيت ، واحتضنه عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة.
3. اغسلي الكوفيت بالماء عدة مرات لتنظيف الكوفيت. قم بإجراء مسح ضوئي للماء أو المخزن المؤقت في الكوفيت للتحقق مما إذا كانت نظيفة.
   ملاحظه: يجب أن يعطي الماء أو المخزن المؤقت قراءة في نطاق mdeg من 0 إلى 1.

< p class = "jove_title" >3. تحضير البروتينات وقليل النوكليوتيد DNA

1. حافظ على حجم البروتين أقل من 50 ميكرولتر في التفاعل لتقليل كميات المكونات العازلة التي تتسبب أحيانا في تكوين قمم غامضة. احتفظ بالبروتين على الجليد طوال التجربة لتجنب أي تدهور.
2. استخدم قليل النوكليوتيدات الحمض النووي المنقى PAGE في التفاعلات.
   ملاحظه: في التفاعلات الموضحة هنا ، تم استخدام الحمض النووي في كل من الأشكال الأصلية والمبردة بالحرارة (التبريد السريع (FC) والتبريد البطيء (SC)). يعزز التبريد السريع الترابط داخل الجزيئات في الحمض النووي ، مما ينتج عنه المزيد من الهياكل الثانوية. في المقابل ، يعزز التبريد البطيء الترابط بين الجزيئات في الحمض النووي ، مما يؤدي إلى عدد أقل من الهياكل الثانوية.
3. للتبريد السريع ، قم بتسخين الحمض النووي عند 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق على كتلة التسخين وقم بتبريده على الفور على الثلج. للتبريد البطيء ، قم بتسخين الحمض النووي عند 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق واتركه يبرد إلى درجة حرارة الغرفة بمعدل 1 درجة مئوية في الدقيقة.

4. إعداد تجارب التحكم لتسجيل أطياف خط الأساس

1. حافظ على حجم التفاعل عند 300 ميكرولتر في جميع التفاعلات. إعداد ما مجموعه 5 تفاعلات أساسية في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل ، واحدة تلو الأخرى ، على النحو التالي: 1) عازلة + ماء ؛ ب) عازلة + MgCl₂ + ATP + ماء ؛ ج) عازلة + MgCl₂ + ATP + بروتين + ماء ؛ رابعا) ثالثا + EDTA أو ADAADiN. خامسا) عازلة + بروتين + ماء.

5. إعداد التجارب لتسجيل أطياف الأقراص المضغوطة

1. قم بإعداد ما مجموعه 5 تفاعلات ، واحدة تلو الأخرى ، في أنابيب طرد مركزي سعة 1.5 مل على النحو التالي: ط) عازلة + DNA + ماء ؛ ب) عازلة + DNA + MgCl₂ + ATP + ماء ؛ ج) عازلة + DNA + MgCl₂ + ATP + بروتين + ماء ؛ رابعا) ثالثا + EDTA أو ADAADiN. خامسا) عازلة + حمض نووي + بروتين + ماء.

6. تسجيل المسح

الضوئي

1. قم بتشغيل الغاز وقم بتشغيل مطياف القرص المضغوط.
2. قم بتشغيل المصباح بعد 10-15 دقيقة ، قم بتشغيل الحمام المائي واضبط درجة حرارة الحامل على 37 درجة مئوية.
3. افتح برنامج طيف الأقراص المضغوطة.
   1. اضبط درجة الحرارة على 37 درجة مئوية.
   2. اضبط نطاق الطول الموجي على 180 - 300 نانومتر.
   3. اضبط الوقت لكل نقطة على 0.5 ثانية.
   4. اضبط رقم المسح الضوئي على 5.
   5. انقر فوق Pro-Data Viewer ، وقم بإنشاء ملف جديد ، وأعد تسميته بتفاصيل حول التجربة والتاريخ.
4. احتفظ بجميع مكونات التفاعل على الجليد لتجنب أي تدهور. اصنع خطوط الأساس والتفاعلات، واحدة تلو الأخرى، في أنابيب الطرد المركزي واخلطها عن طريق سحب العينات. انقل مزيج التفاعل إلى الكوفيت بعناية ، مع التأكد من عدم وجود فقاعات هواء.
5. في حالة إجراء تجربة زمنية ، احتضان التفاعلات عند 37 درجة مئوية للوقت المطلوب وقم بإجراء الفحص. أضف EDTA إلى المخزن المؤقت الذي يحتوي على الحمض النووي و ATP و Mg ^{+ 2} والبروتين لإيقاف التحلل المائي ل ATP.
6. زيادة تركيز EDTA ووقت حضانة EDTA لتثبيط نشاط ATPase تماما.
7. اطرح خطوط الأساس من التفاعلات المقابلة في البرنامج (على سبيل المثال ، اطرح التفاعل 1 من خط الأساس 1). قم بتنعيم البيانات إما في برنامج طيف الأقراص المضغوطة أو في برنامج رسم البيانات. رسم البيانات في برنامج رسم البيانات.
   ملاحظه: سيؤدي طرح خطوط الأساس من التفاعلات المقابلة إلى إعطاء صافي أطياف القرص المضغوط للحمض النووي فقط.

< p class = "jove_title" >7. تحليل البيانات وتفسيرها

1. استخدم الصيغة الواردة في المعادلة (1) لتحويل القيم التي تم الحصول عليها بالملليدرجات إلى يعني إهليلجية البقايا.
   
   هنا ، S هي إشارة القرص المضغوط بالملليدرجات ، c هي تركيز الحمض النووي بالملجم / مل ، mRw هي متوسط كتلة البقايا ، و l هو طول المسار بالسنتيمتر.
2. ارسم رسما بيانيا مقابل الطول الموجي ومتوسط القطع البيضوي للبقايا باستخدام برنامج رسم البيانات وتحليل القمم.
3. لرسم الرسم البياني ، حدد متوسط الإهليلجية للبقايا على المحور Y والطول الموجي على المحور X وارسم رسما بيانيا مستقيما.
   ملاحظه: سيوفر هذا الرسم البياني القمم المميزة لأشكال مختلفة من الحمض النووي. يمكن تحديد أشكال الحمض النووي المقابلة للقمم باستخدام الأدبيات الموجودة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أدينوزين 5′-ثلاثي فوسفات هيدرات ملح ثنائي الصوديوم سيغمالدريتش أ 2383 سي دي كوارتز كوفيت ستارنا 21-س-1 مطياف Chirascan V100 CD الفيزياء الضوئية التطبيقية غير متوفر EDTA ثنائي الصوديوم ملح ثنائي الهيدرات SRL هاتف: 43272 محلول تنظيف Hellmanex III هيلما 9-307-011-4-507 كلوريد المغنيسيوم سداسي هيدرات فيشر علمي م 33-500 فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائي فيشر علمي S374-500 فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة أحادي الهيدرات فيشر علمي S369-500 قارئ الصفيحة الدقيقة Synergy HT بيوتك غير متوفر قاعدة تريس فيشر علمي بي ت 152-500