$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
فئة
1. تحضير مجسات الأشعة فوق البنفسجية / رامان
- تحضير حل AuNP العاري
- تحضير محلول 2 مل من AuNPs بتركيز حوالي 1 × 1011 جزيئات لكل مل.
- إذا كانت AuNPs بحاجة إلى التركيز ، فاملأ أنابيب الطرد المركزي منخفضة الارتباط ب 2,000 ميكرولتر من AuNP وأجهزة الطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 20 دقيقة أو حتى يصبح الطاف صافيا. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سحب العينة ، مع الحرص على عدم إزعاج حبيبات AuNP.
- اجمع محاليل AuNP المتبقية في أنبوب واحد وقم بتقدير التركيز عن طريق الحصول على قياس UV-Vis ومقارنة القيم بالتركيزات المعروفة لأن هذه علاقة خطية.
- تحديد نسبة وضع العلامات المناسبة لمراسل رامان
- قم بإعداد حل عملي لمراسل رامان المذاب في الميثانول. سيعتمد هذا التركيز على المراسل المستخدم. في هذا العمل ، قم بإعداد يوديد 3،3 ′-ثنائي إيثيل ثياترياكربوسيانن (DTTC) في محلول عملي 200 ميكرومتر.
- بافتراض الحجم النهائي البالغ 100 ميكرولتر لكل بئر ، أضف ما يكفي من محلول المراسل العامل إلى كل بئر من الصف الأول من صفيحة مكونة من 96 بئرا بحيث تتراوح تركيزات مراسل رامان من 0.2 ميكرومتر إلى 10 ميكرومتر. أضف ما يكفي من الماء من درجة HPLC إلى كل بئر بحيث يكون الحجم 80 ميكرولتر. أضف 20 ميكرولتر من AuNP إلى كل بئر لتكوين حجم نهائي من 100 ميكرولتر لكل بئر. ويرد مثال في الجدول 1.
- قم بقياس أطياف UV-Vis من 400 إلى 700 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والبصرية لقراءة اللوحة. التركيز المناسب هو أعلى تركيز مع قمم محددة لأطياف الأشعة فوق البنفسجية. كرر الخطوة 2.2.2 عند زيادة التركيزات حتى يتم العثور على أعلى نسبة تركيز لمراسلي رامان إلى AuNPs.
ملاحظه: تؤثر الصبغة وشكل AuNP وحجمها والشركة المصنعة على التركيز المناسب. لذلك ، يجب تقييم الخطوات المذكورة وتغييرها اعتمادا على المكونات المستخدمة. تضمن هذا البروتوكول استخدام صبغة موجبة الشحنة. على هذا النحو ، تم تحسين الربط بين AuNP والمراسل باستخدام AuNPs سالبة الشحنة. تم ذلك باستخدام AuNPs المغطاة بالسترات. راجع قسم المناقشة لمزيد من التفاصيل.
- ربط مراسل رامان و PEG-Ab ب AuNP
- قم بإعداد دفعتين سعة 1.5 مل من مراسل AuNP و Raman بالتركيز المحدد مسبقا ، مما يسمح لمراسل Raman بالارتباط ب AuNPs لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- أضف الجسم المضاد PEGylated (PEG-Ab) إلى دفعة واحدة من محلول مراسل AuNP و Raman لإنشاء نسبة 200: 1 من الأجسام المضادة إلى الجسيمات. سيكون هذا الحل لعينات الاختبار. في أنبوب منفصل للطرد المركزي الدقيق ، أضف مستضد PEGylated إلى الدفعة الأخرى من محلول مراسل AuNP و Raman بنسبة 200: 1 من الجسم المضاد إلى الجسيمات لاستخدامها كعنصر تحكم. احتضن المحاليل لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: ستكون نسبة الأجسام المضادة إلى الجسيمات خاصة ب AuNPs والصبغة المستخدمة ويجب تحسينها لكل حالة على حدة. الهدف هنا هو الحصول على أعلى نسبة من الأجسام المضادة لمجسات AuNP للارتباط بها مع منع تراكم الجسيمات. استخدم المعادلة التالية لتحديد الأحجام المناسبة لجمعها معا:
حيث V هو الحجم ، و C هو التركيز المعبر عنه في الجسيمات أو الأجسام المضادة لكل مل. يجب أن يكون الحجم النهائي حوالي 1.5 مل.
- حظر المواقع المتبقية على سطح AuNP باستخدام mPEG-SH.
- قم بإعداد mPEG-SH عن طريق إذابة الميثوكسي الصلب بولي إيثيلين جلايكول ثيول إلى تركيز 200 ميكرومتر باستخدام الماء. قم بتدوير المحلول حتى يذوب mPEG-SH تماما.
- أضف mPEG-SH بنسبة 40,000:1 إلى حل AuNP-PEG-Ab المصنوع في الخطوة 2.3. احتضان المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لضمان حظر المواقع المتبقية على الجسيمات النانوية الذهبية. استخدم المعادلة التالية لتحديد الأحجام المناسبة لجمعها معا:
حيث V هو الحجم ، و C هو التركيز المعبر عنه في الجسيمات أو الأجسام المضادة لكل مل. يجب أن يكون الحجم النهائي حوالي 1.5 مل.
- استعادة مجسات رامان الوظيفية.
- جزيئات أجهزة الطرد المركزي عند 5,000 × جم لمدة 20 دقيقة في أنابيب الطرد المركزي منخفضة الارتباط أو حتى يصبح المادة الطافية صافية. قم بإزالة المادة الطافية عن طريق سحب العينة مع الحرص على عدم إزعاج AuNPs.
- أعد تعليق الجسيمات ب 1 مل من محلول 1x PBS الذي تم تصنيعه مسبقا. قم بتقدير تركيز AuNP عن طريق أخذ قياس UV-Vis لحجم صغير من المحلول (3 ميكرولتر) ومقارنة النتائج بالقياسات من تركيز AuNP المعروف. اضبط مستوى الصوت بحيث يكون المحلول النهائي 1 × 1011 جسيما على الأقل لكل مل.
- قم بتخزين المحاليل في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى يتم استخدامها لتشغيل لوحة المقايسة المناعية. استخدم الحلول في غضون أسبوع واحد.
الجدول 1. مثال على تخفيف DTTC. التخفيفات المختلفة ل DTTC والأحجام المرتبطة بها من DTTC ، محلول الجسيمات النانوية للذهب ، والماء.
مجلدات لإضافتها من كل مكون (مل)
التركيز النهائي DTTC (مليمتر)
حل عمل DTTC (200 ملم)
AuNP
الماء
0.2
0.1
20
79.9 دولار
0.6
0.3
20
79.7
1
0.5
20
79.5
2
1.0
20
79
5
2.5
20
77.5
7
3.5
20
76.5
10
5.0
20
75
< p class = "jove_title" >
2. تحضير لوحة المقايسة المناعية
- اربط المستضد المطلوب بلوحة المقايسة المناعية.
- قم بإعداد ما يكفي من المستضدات المخففة (50 ميكروغرام / مل) لملء آبار البوليسترين. دوامة الحل ، وأضف المحلول على الفور إلى آبار اللوحة. اسمح للمستضد بالارتباط بالألواح لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
- اغسل المستضدات غير المرتبطة.
- قم بإزالة محلول المستضد الزائد عن طريق إلقاء المحلول في حاوية التخلص وضرب اللوحة على سطح طاولة مغطى بمنشفة ورقية.
- أضف TBST إلى الآبار لغسل السطح ثم قم بإزالة الغسيل بنفس الطريقة المذكورة سابقا. كرر هذه الخطوة مرتين أخريين.
- قم بحظر مواقع الربط المتبقية على اللوحة لمنع الارتباط غير المحدد.
- أضف 70 ميكرولتر من محلول حجب HSA إلى كل بئر من اللوحة واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- قم بإزالة اللوحة وشطفها باستخدام نفس الإجراء المحدد في الخطوة 3.2. غطي الطبق واحفظيه جافا على حرارة 4 درجات مئوية حتى يصبح جاهزا للاستخدام مرة أخرى.
- وظيفية لوحة المقايسة المناعية.
- أضف 70 ميكرولتر من الجسيمات النانوية للمسبار المحضرة في القسم 2 إلى العمود الأول من صفيحة مكونة من 96 بئرا وقم بتخفيف الأعمدة اللاحقة باستخدام التخفيف التسلسلي 1: 2. اترك اللوحة تحتضن لمدة 1 ساعة على الأقل. يتم إعطاء مثال على كيفية تحضير لوحة المقايسة المناعية في الشكل 1.
- اغسل اللوحة باستخدام TBST خمس مرات كما هو مفصل في الخطوة 3.2 ، مع التأكد من التخلص من AuNPs بشكل مناسب. بعد الغسيل النهائي ، أضف 70 ميكرولتر من 1x PBS إلى كل بئر وقم بتغطيتها بختم لوحة.
ملاحظة: يجب أن تكون عينات التحكم واضحة. إذا حدث الارتباط غير المحدد، فسيكون لعينات التحكم لون مماثل لعينات الاختبار.
- اختبار حساسية الفحص بواسطة التحليل الطيفي للأشعة فوق البنفسجية ورؤوس رامان.
- لكل بئر ، قم بقياس أطياف UV-Vis التي تتراوح من 400 إلى 700 نانومتر باستخدام مقياس الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية والبصرية لقراءة الصفائح.
- باستخدام مجهر رامان المقلوب ، ركز الهدف على سطح البئر الذي يحتوي على مجسات AuNP. الحصول على أطياف رامان من البئر. اجمع طيفا يتراوح من 1,800 سم -1 إلى 400 سم -1. كرر هذه الخطوة لجميع الآبار.
- باستخدام البرامج الطيفية المناسبة ، قم بإجراء تصحيح خط الأساس متعدد الحدود من الدرجة 11 لأطياف رامان وكثير الحدود من الدرجة 3 لأطياف الأشعة فوق البنفسجية.
- باستخدام البرامج الطيفية المناسبة ، قم بتطبيع أطياف Raman و UV-Vis. قم بتعيين الحد الأقصى للقيمة إلى 1 وقم بقياس جميع القيم الأخرى وفقا لذلك. لتطبيع أطياف رامان ، حدد ذروة البوليسترين الفريدة واضبطها على 1 ، وقم بقياس جميع القيم الأخرى وفقا لذلك.
- باستخدام البرامج الطيفية المناسبة ، قم بإجراء تكامل الذروة لكل الطيف. بالنسبة لأطياف رامان ، يجب أن تكون القمة التي تمثل مراسل رامان في منطقة غائبة عن قمم البوليسترين. لإجراء تكامل الذروة، حدد الحدود المتكاملة للذروة المطلوبة وسجل منطقة الذروة المطلوبة لجميع العينات بما في ذلك عناصر التحكم.
- ارسم متوسط منطقة الذروة ذات الاهتمام كدالة لسجل تركيز AuNP مع أشرطة الخطأ لكل نقطة تشير إلى الانحراف المعياري المرتبط بها. قم بتركيب نقاط المعايرة هذه على منحنى لوجستي مكون من 4 معلمات.
- حدد متوسط قيمة الفراغ عن طريق حساب متوسط مساحة ذروة الاهتمام لعينة فارغة. تحديد الانحراف المعياري لهذه المناطق؛ هذا هو الانحراف المعياري للفراغ.
- بالنسبة لنفس الذروة التي تم تحليلها في الخطوة السابقة ، أوجد الانحراف المعياري لمنطقة الذروة هذه لأدنى تركيز.
- احسب حد الفارغ والحد الأدنى للكشف كما هو محدد في قسم النتائج التمثيلية. استخدم هذه القيم مع منحنيات معايرة 4PL لتحديد LLOD من حيث تركيز AuNP.
