توصيل المكورات السحائية داخل القناة إلى نماذج الفئران للحث على التهاب السحايا بالمكورات السحائية

الملخص

المصدر: Pagliuca ، C. ، et al. ، إحداث التهاب السحايا بالمكورات السحائية المجموعة المصلية C في الفئران عبر الولادة داخل الخزان. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نوضح التوصيل داخل الخزف للنيسرية السحائية في نموذج فأر لتوليد عدوى التهاب السحايا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. الحقن داخل الصهريج للفئران

ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراء بأكمله في خزانة التدفق الصفحي للحفاظ على الظروف المعقمة.

1. فئران المختبر المنزلية (8 أسابيع ، أنثى Balb / c) في ظل ظروف محددة خالية من مسببات الأمراض. توفير كريات الطعام والمياه المجانية.
2. استقر في البيئة الجديدة لمدة أسبوع واحد قبل بدء التجربة.
3. قبل البدء في التجربة ، قم بوزن وتقييم درجة حرارة أجسامهم.
   ملاحظه: تزن إناث الفئران الفطرية Balb / c البالغة من العمر ثمانية أسابيع حوالي 19 جراما في المتوسط. يتراوح متوسط درجة حرارة فئران المختبر من الناحية الفسيولوجية من 36-38 درجة مئوية.
قم
4. بإزالة من الرقبة ، وتنظيف منطقة البطن باستخدام 70٪ من الإيثانول ، وحقن ديكستران الحديد IPC (مذاب في محلول ملحي للفوسفات بنسبة 1٪ ، 250 مجم / كجم) في الربع الأيمن السفلي من بطن الفئران باستخدام إبرة 25 جم 0.5 مم × 16 مم ، قبل حوالي 2-3 ساعات من الإصابة.
   ملاحظه: تم إجراء الحقن داخل الصفاق في الربع الأيمن السفلي من بطن الفئران لتجنب إتلاف أعضاء البطن مثل المثانة البولية والأذر وما إلى ذلك. إن إعطاء مصدر الحديد الخارجي ، على شكل ديكستران الحديد ، للحيوانات قبل الإصابة يفضل تكاثر البكتيريا في المضيف.
5. بعد 2-3 ساعات ، يتم إجراء تخدير حيواني بالكيتامين (50 مجم / كغ) والزيلازين (3 مجم / كغ) ومواد تشحيم العين.
6. تحقق من عمق التخدير عن طريق التأكد من عدم وجود استجابة للألم عند الضغط على إصبع القدم.
7. ضع الفأر في الاستلقاء القصي وقم بتمديد الأطراف والعمود الفقري العنقي بعناية للحفاظ على العمود الفقري في وضع مستقيم.
8. امزج التعليق البكتيري برفق للحفاظ على تعليق ثابت قبل تحميل حقنة من إبرة 30 جم × 8 مم.
   ملاحظه: تحضير المعلق البكتيري في أقرب وقت ممكن من وقت الحقن ؛ في غضون ذلك ، قم بتخزينه في درجة حرارة الغرفة.
9. استنادا إلى عيار البكتيريا بعد الذوبان (CFU / mL) ، تابع حساب إجمالي CFU المراد استخدامه ، فيما يتعلق بالعدد الإجمالي للحيوانات المصابة (جرعة بكتيرية CFU لكل عدد من). تابع حساب الحجم الدقيق الذي سيتم أخذه من القارورة للحصول على إجمالي CFU عن طريق تطبيق نسبة بين العيار البكتيري بعد الذوبان (CFU / مل) وإجمالي CFU المفيد لإصابة n الفئران (عيار البكتيري بعد الذوبان CFU: مل = إجمالي CFU: x). حدد المجلد النهائي فيما يتعلق بالعدد الإجمالي للحيوانات المصابة.
   ملاحظه: في هذه التجارب ، تم استخدام مجموعة واسعة من العيارات من 10⁴ إلى 10⁹ لكل.
10. نظف منطقة الجراحة بنسبة 70٪ من الإيثانول.
11. حدد نقطة الحقن بمساعدة إبرة وحقن CFU الراسخ للمكورات السحائية (سلالة من النوع البري وسلالة متساوية الجين) ، أو مرق GC مكمل بديكستران الحديد (5 مجم / كجم) كعنصر تحكم ، بحجم إجمالي قدره 10 ميكرولتر في صهريج الفئران من خلال ثقب لدغ قذالي باستخدام إبرة 30 جم × 8 مم.
    1. قم بإجراء اللقاح الصهريجي عن طريق وضع الإبرة عند الوصلة القحفية العنقية ، وتحديدا في الفضاء الظهري تحت العنكبوتية. قم بفني الرأس لتسهيل الوصول إلى هذه المساحة.
    2. باختصار ، ضع في حالة استلقاء جانبي ، وأبعد الأذنين عن الطريق ، وثني الرقبة بشكل معتدل (90 إلى 100 درجة). تأكد من أن خط الوسط للرقبة والرأس (من الأنف إلى القفف) في وضع مواز تماما للطاولة.
    3. المس أجنحة الأطلس وتأكد من تداخلها ، مما يلغي الدوران المحوري. يمكن عادة لمس المسافة البادئة الطبيعية على خط الوسط حيث من المرجح أن تدخل الإبرة إلى الثقب القذالي.
    4. تخلص من المحقنة والإبرة بأمان بعد حقن الفئران بالنيسيريا.
12. ضع في القفص وانتظر الاستيقاظ والتعافي الكامل للحركة.
13. احتفظ بالأقفاص التي تحتوي على الفئران المصابة تحت خزانة تدفق رقائقي.
14. مراقبة الفئران ، بعد 24 ساعة من الإصابة ، بحثا عن العلامات السريرية للغيبوبة وفقا لمقياس الغيبوبة. مقياس الغيبوبة: 1 = غيبوبة ، 2 = لا يقف منتصبا بعد أن يقلب على ظهره ، 3 = يقف منتصبا في غضون 30 ثانية ، 4 = يقف منتصبا في غضون 5 ثوان ، الحد الأدنى من الأنشطة المتنقلة ، 5 = عادي.
    ملاحظه: عندما تم تسجيل الألم في ، تم إعطاء التسكين مع الميلوكسيكام (5 مجم / كجم IPA طوال مدة الدراسة).

< p class = "jove_title" >2. بقاء وتهم CFU

1. بقاء
   1. تحضير اللقاحات البكتيرية بجرعات مختلفة (تتراوح من 10⁴ إلى 10⁹ CFU لكل فأر) لإصابة عن طريق i.cist.
   2. تلقيح الفئران الضابطة بمرق GC ، مكمل ديكستران الحديد (5 مجم / كغ) ، بنفس الطريقة.
   3. راقب بحثا عن الأعراض السريرية: الفراء المكشكشة ، أو المظهر المنحني ، أو انخفاض حرارة الجسم ، أو فقدان الوزن ، أو الخمول ، أو الاحتضار كل يوم طوال التجربة بأكملها لمدة 168 ساعة (7 أيام) مرتين على الأقل يوميا طوال مدة التجربة.
   4. قم بقياس وزن الجسم ودرجة حرارته باستخدام ميزان رقمي ومقياس حرارة المستقيم ، على التوالي كل يوم.
   5. سجل بقاء الفئران لمدة أسبوع.
      ملاحظه: سجل الموت الطبيعي للحيوان بعد الإصابة بينما سيتم القتل الرحيم للحيوانات التي تصل إلى قيمة غيبوبة 2 أو التي تعيش أكثر من 168 ساعة من المراقبة.
   6. تخدير الفئران التي تبلغ قيمتها غيبوبة 2 أو التي تعيش خلال فترة الملاحظة بالكيتامين (50 ملغم/كغ) والزيلازين (3 ملغم/كغ) ووضع مرهم العيون.
   7. تأكد من غياب استجابة الألم بسبب قرصة إصبع القدم.
   8. إجراء القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم وتسجيلها على أنها ميتة للتحليل الإحصائي.
   9. المضي قدما في اختبار حساب بقاء أو CFU على المصابة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ميزان حرارة الإنذار تيستو 9000530 جهاز حقنة BD مايكرو فاين دينار بحريني 320837 أنسولين U-100 حقنة BD Plastipak 1 مل 25GA 5/8in دينار بحريني 300014 05 × 16 ملم حقنة BD Plastipak 5 مل دينار بحريني 308062 07 × 30 ملم خزانة التدفق الصفحي العمودي BIOHAZARD AURA B بيو ش.س.ر.ل. هالة B3 جهاز حاضنة C150 CO₂ الموثق 9040-0078 جهاز شهادة Diete Standard موسيدولا إس آر إل 4RF21 بيليه الغذاء للحيوان دومونت اتش بي ملاقط 5 ستانلس ستيل F.S.T. بواسطة DUMONT AGT5034 طرف 0,10 × 0,06 مم الميزان الإلكتروني جيبرتيني الاتحاد الأوروبي-C1200 1200 جرام كحد أقصى ، د = 0.01 جرام ، T = -1200 جرام محلول ديكستران الحديد سيجما ألدريتش D8517-25ML الكيتامين إنترفيت خزانة السلامة الميكروبيولوجية BH-EN و BHG من الفئة الثانية أسرع BH-EN 2004 أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 مل وسم PP780751 غطاء المسمار PP ، grad ملقط التعامل مع الماوس ف. س. ت. 11035-20 المطاط المسنن سطح الإمساك: 15 × 20 مم قفازات اللاتكس الطبيعية ميديكا م 101 تاتش إن توف قفازات النتريل التي يمكن التخلص منها انسل 92-500 زيلازين إنترفيت