مراقبة ديناميكيات تجنيد العدلات والعبء البكتيري في موقع العدوى في نموذج الفئران

الملخص

المصدر: أندرسون، إل إس، وآخرون. نموذج فأر لتقييم الاستجابة المناعية الفطرية لعدوى المكورات العنقودية الذهبية. J. Vis. Exp. (2019).

يوضح هذا الفيديو التصوير في الجسم الحي لدراسة ديناميكيات تجنيد العدلات في موقع العدوى في فأر معدد ومعدل وراثيا يعاني من نقص المناعة مع عدلات تعبر عن GFP. يتضمن حقن البكتيريا المضيئة لإحداث العدوى. يؤدي هذا إلى تجنيد العدلات في موقع العدوى ، والذي يتم تتبعه عن طريق التصوير.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

1. مصدر الماوس والإسكان

1. اشتقاق الفئران LysM-eGFP على خلفية وراثية C57BL / 6J. اشتقاق الفئران LysM-EGFP×MyD88 ^{- / -} عن طريق عبور فئران LysM-EGFP مع الفئران MyD88 ^{- / -} على خلفية C57BL / 6J.
2. الفئران المنزلية في فيفاريوم. بالنسبة لهذه الدراسات ، تم إيواء في جامعة كاليفورنيا ، ديفيس في مجموعات قبل الجراحة ومنزل واحد بعد الجراحة. استخدم الفئران التي تتراوح أعمارها بين 10-16 أسبوعا.

< ص الفئة = "jove_title" >2. تحضير البكتيريا والقياس الكمي

1. قم بإزالة سلالة المكورات العنقودية الذهبية ذات الأهمية من التخزين -80 درجة مئوية لإذابة الجليد. خط على صفيحة أجار الدم البقري بنسبة 5٪. احتضان الصفيحة المخططة في حاضنة مرطبة عند 37 درجة مئوية طوال الليل (16 ساعة).
   ملاحظه: في هذا البروتوكول ، تم استخدام سلالة ALC2906 SH1000. تحتوي هذه السلالة على البلازميد المكوكي pSK236 مع محفزات البروتين المرتبط بالبنسلين 2 المدمجة في كاسيت مراسل luxABCDE من Photohabdus luminescens.
2. تحضير مرق الصويا التريبتسي (TSB) عن طريق خلط 0.03 جم من مسحوق TSB لكل مل من الماء النقي ، والأوتوكلاف TSB للتعقيم. عندما تبرد ، أضف أي مضادات حيوية ضرورية باستخدام تقنية معقمة. في هذا البروتوكول ، أضف 10 ميكروغرام / مل من الكلورامفينيكول إلى TSB للاختيار للتعبير عن البلازميد المكوكي pSK236 ، والذي يحتوي على كاسيت luxABCDE التلألؤ الحيوي.
3. اختر 3-4 مستعمرات منفصلة من صفيحة المكورات العنقودية الذهبية في TSB مع 10 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول لبدء زراعة بين عشية وضحاها. احتضان البكتيريا على شاكر الحضانة عند 37 درجة مئوية طوال الليل (16 ساعة).
4. ابدأ مزرعة بكتيرية جديدة من المزرعة الليلية عن طريق تخفيف عينة 1:50 إلى TSB مع 10 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول. استزراع في شاكر حاضنة عند 200 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
5. بعد ساعتين من تقسيم المكورات العنقودية الذهبية ، راقب الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) على مقياس الطيف الضوئي. راقب OD₆₀₀ مقابل الوقت للعثور على نمو الطور اللوغاريتمي المتوسط. بالنسبة لسلالة ALC2906 SH1000 ، فإن OD₆₀₀ من 0.5 هو متوسط لوغاريتمي ويتوافق مع تركيز 1 × 10⁸ CFU / مل (الشكل 1).
6. عندما يكون OD₆₀₀ 0.5 ، اغسل البكتيريا 1: 1 باستخدام DPBS المثلج. قم بالطرد المركزي للبكتيريا لمدة 10 دقائق عند 3,000 × جم و 4 درجات مئوية. صب المادة الطافية بعناية وأضف DPBS مبردة ودوامة جيدا. جهاز طرد مركزي مرة أخرى لمدة 10 دقائق عند 3,000 × جم و 4 درجات مئوية.
7. صب بعناية المادة الطافية أعد تعليق الحبيبات البكتيرية بالتركيز المطلوب. لهذه الدراسات ، اجمع 3 مل من ALC2906 SH1000 وأعد تعليقها في 1.5 مل من PBS ، مرتبطة بتركيز بكتيريا يبلغ حوالي 2 × 10⁸ CFU / مل. احتفظ بالبكتيريا على الثلج حتى الاستخدام.
8. للتحقق من تركيز البكتيريا ، قم بتخفيف 100 ميكرولتر من العينة البكتيرية 1: 10،000 و 1: 100،000 في PBS. لوحة 20 ميكرولتر على لوحة أجار. احتضان عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة لمدة 16 ساعة. عد CFUs عن طريق الفحص الإجمالي وحساب تركيز البكتيريا في اليوم التالي.

< p class = "jove_title" >3. جرح الجلد الاستئصالي والتلقيح بالمكورات العنقودية الذهبية

1. يجب تطبيق 100 ميكرولتر من 0.03 ملغم/مل بوبرينورفين هيدروكلوريد (~0.2 ملغم/كغ) لكل فأر عن طريق الحقن داخل الصفاق.
2. بعد عشرين دقيقة من الحقن ، ضع 2-4 فئران في غرفة بها 2-3 لتر في الدقيقة أكسجين مع 2-4٪ إيزوفلوران. بمجرد تخدير الفئران بالكامل ، انقل الفئران واحدة تلو الأخرى إلى مخروط أنف متصل ب 2-3 LPM أكسجين مع 2-4٪ إيزوفلوران. تحقق من تخدير الفئران بالكامل عن طريق الضغط بإحكام على كل مخلب خلفي بين الإبهام والسبابة. انتقل إلى الخطوة التالية إذا لم يستجب للقرصة.
3. احلق قسما مقاس 1 بوصة × 2 بوصة على الجزء الخلفي من الماوس باستخدام مقص كهربائي وقم بتنظيف منطقة قصاصات الفراء باستخدام منديل نظيف أو شاش. تجنب استخدام غسول إزالة الشعر لأنه قد يسبب التهابا زائدا.
4. نظف الجزء الخلفي من الماوس أولا بشاش مبلل باليود بنسبة 10٪ ثم بشاش مبلل بالإيثانول بنسبة 70٪. نظف المنطقة بنمط حلزوني ، وتحرك للخارج من مركز منطقة الجراحة. انتظر حوالي 1 دقيقة حتى تجف منطقة الجراحة قبل الجراحة.
5. أمسك الجزء الخلفي المحلوق من الفأر بشكل غير محكم بين إصبعين واضغط بقوة على خزعة مثقبة معقمة مقاس 6 مم في وسط المنطقة الجراحية المعدة. لا تسحب الجلد مشدودا.
   1. قم بلف الخزعة المثقوبة لإنشاء مخطط دائري على الجلد يقطع الجلد بالكامل في قسم واحد على الأقل من المخطط التفصيلي. احرص على عدم قطع اللفافة أو الأنسجة الأساسية.
   2. استخدم مقصا وملقطا معقما لقطع البشرة والأدمة باتباع النمط الدائري المطبوع بالخزعة المثقوبة.

< p class = "jove_title" >4. S. aureus التلقيح

1. املأ حقنة الأنسولين 28 جم باللقاح البكتيري المضيء الحيوي المطلوب. في هذه الدراسة ، قم بإعطاء تركيز 1 × 10⁸ CFU / مل (50 ميكرولتر). لا تقم بإعطاء أكثر من 100 ميكرولتر من الحجم.
2. حقن 50 ميكرولتر من اللقاح بين اللفافة والأنسجة الموجودة في وسط الجرح على ظهر الفأر. تأكد من أن اللقاح يشكل فقاعة في وسط الجرح بأقل قدر من التسرب أو التشتت.
   1. اسحب الأدمة إلى الجانب ، وامسك المحقنة بالتوازي تقريبا مع الأنسجة ، وادفع المحقنة ببطء إلى الأنسجة حتى يشعر بانخفاض مفاجئ في المقاومة ، مما يشير إلى ثقب اللفافة. قم بقيادة المحقنة بعناية إلى وسط الجرح وقم بتوزيع اللقاح ببطء. قم بإزالة المحقنة ببطء من.
3. حقن نفس الحجم من PBS المعقم في جروح غير المصابة كما هو موضح أعلاه.
4. أعد إلى قفصه. ضع القفص تحت مصباح حراري أو فوق وسادة تدفئة ، وراقب حتى الشفاء من التخدير.

5. في Vivo BLI و FLI

1. قم بتهيئة جهاز تصوير بالكامل من خلال برنامج الأداة. تخدير الفئران في غرفة تتلقى 2-3 LPM أكسجين مع 2-4٪ إيزوفلوران. توصيل التخدير إلى مخارع الأنف داخل جهاز التصوير.
2. ضع الفأر الجريح والمصاوب في جهاز التصوير. ضع الماوس بحيث يكون الجرح مسطحا قدر الإمكان. استخدم إعداد التسلسل التالي لتصوير الفئران.
   1. حدد اللمعان والتصوير الفوتوغرافي كوضع التصوير. وقت التعرض هو 1 دقيقة عند تجميع صغير و F / stop 1 (لمعان) و F / stop 8 (صورة). مرشح الانبعاث مفتوح. انقر على اكتساب زر لتسجيل الصورة.
   2. حدد Fluorescence وPhotograph كوضع التصوير. وقت التعرض هو 1 ثانية عند تجميع صغير و F / stop 1 (تألق) و F / stop 8 (صورة) بطول موجي إثارة يبلغ 465/30 نانومتر وطول موجي انبعاث يبلغ 520/20 نانومتر مع كثافة مصباح عالية. انقر على اكتساب زر لتسجيل الصورة.
3. أعد إلى قفصه وراقبه حتى الشفاء من التخدير.
4. صور الفئران يوميا كما هو موضح أعلاه.

< p class = "jove_title" >6. تحليل الصور

1. افتح الصور ليتم تحديدها كميا.
2. ضع منطقة دائرية كبيرة محل اهتمام (ROI) على منطقة الجرح بأكملها بما في ذلك الجلد المحيط لكل فأرة في الصورة. إشارات العدلات في الجسم الحي FLI EGFP وفي الجسم الحي BLI S. تمتد إشارات S. aureus إلى ما وراء حافة الجرح بعد عدة أيام وتم تضمينها في هذه الدراسات (الشكلان 2 أ و 2 ب). انقر فوق قياس عائد الاستثمار وسجل قيم متوسط التدفق لكل ماوس. ارسم متوسط تدفق كل إشارة (p / s) مقابل الوقت.
3. إذا كانت الأعداد المطلقة من العدلات أو المكورات العنقودية الذهبية مطلوبة في الجرح ، فقم بإجراء التجارب التالية.
   1. لربط أرقام العدلات بإشارات FLI EGFP في الجسم الحي ، جرح الفئران C57BL / 6J كما هو موضح أعلاه ، ونقل مجموعة من العدلات المشتقة من نخاع العظام (5 × 10⁵ إلى 1 × 10⁷) من LysM-EGFP أو LysM-EGFPxMyD88 ^{- / -} المتبرعين مباشرة فوق الجروح المختلفة. الصورة كما هو موضح أعلاه وتربط إشارات FLI EGFP في الجسم الحي بالكمية المعروفة من العدلات.
   2. لربط المكورات العنقودية الذهبية CFU بإشارات BLI في الجسم الحي ، جرح الفئران وتصيبها كما هو موضح أعلاه. في اليوم الأول ، سجل ما بعد الإصابة في الجسم الحي BLI من الفئران وقتل الجثث وتبريده على الفور. استئصال الجرح ، وتجانس الأنسجة ، ولوحة التخفيفات البكتيرية على أجار للحضانة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي ، عد المستعمرات لتحديد CFU لكل جرح.
4. لقياس التئام الجروح ، قم بتركيب عائد استثمار دائري على حافة الجرح وقم بقياس مساحة الجرح (سم²) وارسم التغيير الجزئي من خط الأساس مقابل الوقت (الشكل 2 ج).

النتائج

الشكل 1: العلاقة بين عدد OD₆₀₀ و CFU ل ALC2906. تم انتقاء مستعمرات 3-4 ALC2906 SH1000 من صفيحة أجار ونقلها إلى TSB مع 10 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول للاستزراع الليلي. في اليوم التالي ، تم تقسيم المعلق 1:50 إلى TSB مع 10 ميكروغرام / مل كلورامفينيكول وزرعته. تم قياس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر (OD₆₀₀) على فترات منتظمة بعد ساعتين باستخدام مقياس الطيف الضوئي. في كل قياس ، تم تخفيف البكتيريا 1: 100،000 في PBS ال...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 14 مل البولي بروبيلين أنبوب دائري القاع صقر 352059 6 مم لكمة خزعة يمكن التخلص منها إنتيجرا ميلتكس 33-36 البلمعان الحيوي المكورات العنقودية الذهبية لويد ميلر ، جونز هوبكنز ALC 2906 SH1000 أجار الدم البقري ، 5٪ ، هاردي التشخيص VWR 10118-938 بوبرينوبرين هيدروكلوريد عن طريق الحقن الإمدادات الطبية الغربية 7292 0.3 ملغم/مل C57BL / 6J الفئران جاكسون لابراتيوري 664 ب كلورامفينيكول (مسحوق بلوري) فيشر الكواشف الحيوية BP904-100 DPBS (1X) جيبكو 14190-144 محاقن الأنسولين بيكتون وديكسون وشركاه 329461 .35 مم (28 جم) × 12.7 مم (1/2 بوصة) نظام التصوير IVIS Spectrum In Vivo بيركين إلمر 124262 برنامج الصور الحية - سلسلة IVIS Spectrum بيركين إلمر 128113 فئران LysM-eGFP توماس جراف ، كلية ألبرت أينشتاين في نيويورك غير أ مقياس الطيف الضوئي الصغير ثيرموفيشر العلمي إن دي-2000 MyD88 KO الفئران جاكسون لابراتيوري 9088 الإسفنج غير المنسوج AMD- Ritmed Inc أ 2101 - سي إتش 5 سم × 5 سم بوفيدون اليود 10٪ محلول أبليكيير 697731 مرق الصويا Tryptic بيكتون وديكسون وشركاه 211825