تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
< p class = "jove_title" >
1. فحص مكتبة مثبطات Kinase (فحص مستقل عن أجهزة الطرد المركزي)
- علاج الخلايا الزعترية بمثبطات كيناز
- تحضير تعليق الخلايا الزعترية.
- قم بتخفيف الخلايا الزعترية في RPMI كامل للحصول على تعليق الخلايا الزعترية 25 × 106 خلايا / مل.
- أضف 40 ميكرولتر من الخلايا الزعترية إلى كل بئر من صفيحة صغيرة الحجم باستخدام ماصة متعددة القنوات. ضع الطبق على الثلج.
- قم بتخفيف المثبطات من لوحة المخزون ، DMSO ، وديكساميثازون في RPMI كامل بنسبة أربعة أجزاء من RPM الكامل إلى جزء واحد من المثبط / DMSO / ديكساميثازون (عامل التخفيف 5).
ملاحظه: نظرا لأن الأحجام المستخدمة في هذه اللوحة صغيرة الحجم أصغر بمقدار 5 مرات مما كانت عليه في الطريقة التقليدية ، يتم تخفيف المثبطات وكواشف التحكم خمسة أضعاف قبل إضافتها إلى الخلايا الزعترية في اللوحة.
- أضف 0.5 ميكرولتر من مثبطات كيناز إلى الصفيحة المكونة من 96 بئرا من الآبار المقابلة للوحة المثبطة المحضرة في الخطوة 1.1.4.
- تحضير ثمانية آبار من الضوابط غير المعالجة. قم بإعداد أربعة آبار من أدوات التحكم المعالجة بالمركبات عن طريق إضافة 0.5 ميكرولتر من DMSO المحضر في الخطوة 1.1.4. قم بإعداد أربعة آبار من 5 ميكرومتر من الضوابط المعالجة بالديكساميثازون ، باستخدام ديكساميثازون المخفف المحضر في الخطوة 1.1.4 (الشكل 1).
فئة
2. تحفيز الخلايا الزعترية باستخدام حبات مضادة ل CD3 / CD28
- تأكد من تعليق الخرزات بشكل موحد. خذ 1 مل من الخرز واغسلها ب 2 مل من PBS. افصل الخرزات باستخدام حامل مغناطيسي واستنشق المحلول. أعد تعليق الخرزات في 1 مل من RPMI.
ملاحظه: نسبة الخرز إلى الخلايا هي 1 إلى 2.5. اضبط كمية الخرزات ، اعتمادا على عدد الآبار المراد تحفيزها وعدد الخلايا الزعترية المستخدمة.
- أضف 10 ميكرولتر من معلق الخرزة إلى كل عينة معالجة بالمثبط ، والعينات الأربع المعالجة ب DMSO ، وأربع من العينات الثمانية غير المعالجة. أضف 10 ميكرولتر من الميل التحضيري الكامل إلى الآبار الأربعة المتبقية غير المعالجة. يوضح الشكل 1 تخطيط اللوحة العام.
ملاحظه: الحجم النهائي للآبار هو 50 ميكرولتر ، وهو ضمن السعة القصوى للآبار. من المهم توخي الحذر وتثبيت الألواح في وضع مستقيم لتجنب انسكاب البئر المتقاطع.
- للخلط ، قم بتحريك اللوحة باستخدام شاكر مداري ميكروليت. بدلا من ذلك، امزج محتويات الآبار باستخدام ماصة متعددة القنوات.
- احتضان الخلايا الصعترية في حاضنة 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 17-20 ساعة (أو بين عشية وضحاها) بغطاء مضاد للتبخر.
< p class = "jove_title" >
3. إعداد غسالة اللوحة
ملاحظة: يتم توفير التعليمات الخاصة بإعداد غسالة اللوحة من قبل الشركة المصنعة. الخطوات مذكورة باختصار أدناه. هناك حاجة إلى ما يقرب من 150 مل من المحلول لكل خطوة تحضير.
- قم بتجهيز نظام الغسيل بنسبة 70٪ إيثانول يحتوي على 1٪ Tween 20.
- قم بتجهيز نظام الغسيل بالماء منزوع الأيونات الذي يحتوي على 1٪ Tween 20.
- قم بتجهيز نظام الغسيل باستخدام عازل الغسيل FACS.
< p class = "jove_title" >
4. تلطيخ المستضدات السطحية
- قم بإعداد خليط تلطيخ الأجسام المضادة يحتوي على أجسام مضادة مضادة ل TCRβ ومضاد ل CD4 ومضاد ل CD8 ومضاد ل CD69. تمييع الأجسام المضادة في مخزن غسيل FACS بنسبة 1: 100 (حجم / حجم).
- اغسل اللوحة 9x ، باستخدام 55 ميكرولتر من عازلة الغسيل FACS لكل غسلة ، باستخدام نظام الغسيل الآلي للتدفق الصفحي.
ملاحظه: في نهاية الغسلات ، سيكون هناك 25 ميكرولتر من الحجم المتبقي في كل بئر.
- أعد تعليق الخلايا في 25 ميكرولتر من خليط الأجسام المضادة المحضرة في الخطوة 1.4.1.
- إذا تم نقل العينات من صفيحة مكونة من 96 بئرا ، فقم بتعليق الخلايا في 50 ميكرولتر من خليط الجسم المضاد ، وانقل العينات إلى اللوحة صغيرة الحجم. تتوافق هذه الخطوة مع الطريقة رقم 2 ، كما هو موضح في الشكل 2 أ.
- للخلط، حرك اللوحة باستخدام شاكر مداري دقيق أو امزج العينات باستخدام ماصة متعددة القنوات، واحتضانها على الجليد لمدة 30 دقيقة.
< p class = "jove_title" >
5. تثبيت الخلايا
- اغسل اللوحة 9 مرات ، باستخدام 55 ميكرولتر من مخزن الغسيل FACS لكل غسلة ، باستخدام نظام الغسيل الآلي بالتدفق الصفيحي.
- أضف المخزن المؤقت للتثبيت / النفاذية (يأتي مع مجموعة موت الخلايا المبرمج النشطة caspase-3 ؛ نفس الشيء مع المخزن المؤقت 10x perm / wash المذكور في الخطوة 1.6.1 والجسم المضاد للكاسباز -3 في الخطوة 1.6.2) عند 50 ميكرولتر لكل بئر.
- احتضن على الثلج لمدة 30 دقيقة.
< p class = "jove_title" >
6. تلطيخ داخل الخلايا للكاسباز النشط 3
- قم بإعداد 1x تجعيد / غسيل عازل عن طريق تخفيف 25 مل من 10x perm / wash buffer في 225 مل من الماء عالي النقاء.
- قم بإعداد صبغة الكاسباز النشطة داخل الخلايا عن طريق إضافة 1 مل من الجسم المضاد للكاسباز -3 إلى 2 مل من 1x بيرم / غسيل. نسبة الجسم المضاد إلى التجعيد / المخزن المؤقت للغسيل هي 1: 2.
- قم بتجهيز نظام الغسيل بمخزن مؤقت 1x perm / wash.
- اغسل الطبق 9x مع 1x بيرم / الغسيل المؤقت ، عند 55 ميكرولتر لكل غسلة.
- أضف 25 ميكرولتر من صبغة الكاسباز داخل الخلايا المحضرة في الخطوة 1.6.2 إلى جميع الآبار.
- للخلط ، قم بتحريك اللوحة باستخدام شاكر مداري دقيق أو امزج العينات باستخدام ماصة متعددة القنوات ، واحتضانها على الجليد لمدة 1 ساعة.
- اغسل الطبق 9x مع 1x بيرم / الغسيل المؤقت ، عند 55 ميكرولتر لكل غسلة.
- أضف 25 ميكرولتر من محلول غسيل FACS إلى جميع الآبار.
- انقل العينات إلى أنابيب الميكروتيتر بعد الخلط الكافي عن طريق سحب العينات.
- أضف 50 ميكرولتر أخرى من محلول غسيل FACS إلى الآبار الفارغة وكرر الخطوة 1.6.9.
- كرر الخطوتين 1.6.9 و 1.6.10 2x حتى يتم جمع 200 ميكرولتر من العينات في أنابيب الميكروتيتر.
ملاحظه: الغرض من الإجراءات الموضحة في الخطوتين 1.6.10 و 1.6.11 هو ضمان أقصى قدر من الاسترداد للخلايا من اللوحة صغيرة الحجم. إذا لم تكن أرقام الخلايا مصدر قلق ، فبعد الخطوة 1.6.10 ، ما عليك سوى تعبئة أنابيب الميكروتيتر إلى 200 ميكرولتر باستخدام مخزن غسيل FACS.
- قم بإجراء تحليل قياس التدفق الخلوي للعينات وتحليل النتائج باستخدام برنامج تحليل FACS. يتم تحليل تنشيط Caspase-3 وتعبير CD69 في البوابة التي تحتوي على الخلايا الزعترية CD4 + CD8 + DP.
