$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.
فئة
1. اشتقاق نخاع العظم من البلاعم وتنشيطه بالأجسام المضادة
- إجراء القتل الرحيم باستخدام ثاني أكسيد الكربون2 الاختناق.
- ضع الماوس في غرفة الحث. قتل الفأر بتخدير إيزوفلوران بنسبة 5٪ ، لمدة 60 - 90 ثانية ، حتى يصبح التنفس عميقا وبطيئا.
- قم بإيقاف تخدير الأيزوفلوران وقم بإعطاء 6-8 لتر / دقيقة من ثاني أكسيد الكربون2 حتى يتوقف الفأر عن التنفس. اترك الماوس مع ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 5 دقائق أخرى على الأقل. تحقق من عدم وجود نبضات قلب أو تنفس. إجراء خلع عنق الرحم لضمان الوفاة.
ملاحظة: توفر الفئران التي يبلغ عمرها 8-12 أسبوعا أعلى إنتاجية من الضامة.
- رش أرجل الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول وقم بتثبيتها بالذراعين والساقين الممتدة في وضع الاستلقاء فوق لوح الرغوة. باستخدام المقص والملقط لتثبيت الجلد ، قم بعمل قطع ضحل (0.2 سم) لإزالة الجلد والفراء من سطح كل من الأرجل الخلفيتية.
ملاحظه: قم بتنفيذ هذا الإجراء وجميع عمليات التلاعب بزراعة الأنسجة في غطاء معقم.
- تقليم العضلات لجعل الظنبوب وعظم الفخذ مرئية. قم بإزالة الظنبوب وعظم الفخذ عن طريق قطع العظام والعضلات أسفل مفصل الورك وفوق الكاحلين. تقليم أكبر قدر ممكن من العضلات.
- رش العظام بنسبة 70٪ من الإيثانول وانتظر دقيقة واحدة حتى تتبخر ، ثم ضعها في طبق مكون من 6 آبار من وسط تدفق العظام (وسيط Dulbecco المعدل من Iscove (IMDM) ، مصل بقري جنين 10٪ (FBS)).
- تقليم أطراف العظام عن طريق قطع 0.1 سم من العظم من الكاحل وأعلى عظم الفخذ بحيث يتعرض تجويف العظام. تأكد من أن النخاع مرئي ويمكن وضع إبرة قياس 26 في تجويف العظام.
- قطع العظام والعضلات لفصل الظنبوب وعظم الفخذ عن مفاصل الركبة. أدخل إبرة قياس 26 متصلة بحقنة سعة 10 مل في التجويف. اغسل نخاع العظم في أنبوب مخروطي سعة 50 مل مع 5 مل من وسط تدفق العظام. اغسل اثنين من الظنبوب واثنين من عظم الفخذ ، من فأر واحد ، في كل أنبوب سعة 50 مل.
- الماصة لأعلى ولأسفل عدة مرات أو دوامة النخاع بسرعة بطيئة لتفريق الكتل برفق. يجب تقسيم خيوط النخاع إلى بقع صغيرة (أقل من 0.5 مم) من النخاع. املأ الأنبوب المخروطي حتى 50 مل بوسط تدفق العظام. محتويات الماصة للأنبوب المخروطي في قارورة 75 سم2 معالجة بزراعة الأنسجة ، وتحتضن عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة 1 ساعة < br / >
ملاحظه: ستصبح الضامة الناضجة والخلايا الوسيطة ملتصقة بالقارورة ويتم التخلص منها ، بينما تظل أسلاف المكونة للدم المرغوبة معلقة.
- ماصة الوسط مع أسلاف المكونة للدم في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. جهاز الطرد المركزي للأنبوب عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات في 5 مل من وسط استزراع عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (MCSF) (IMDM ، 10٪ FBS ، 5 نانوغرام / مل MCSF ، 100 وحدة / مل بنسلين / ستربتومايسين ، و 150 ميكرومتر أحادي الجلسرين (MTG)).
- عد الخلايا باستخدام مقياس كثافة الدم. أضف وسيطا لإعادة تعليق الخلايا بتركيز 0.5 × 106 خلايا / مل ، 1.5 × 107 خلايا / قارورة في 30 مل من الوسط والماصة لأعلى ولأسفل برفق. ماصة 30 مل من التعليق في قارورة جديدة معالجة بزراعة الأنسجة مقاس 75 سم2.
- في اليوم 4 واليوم 7 بعد الثقافة الأولية في الخطوة 1.9 ، تحقق من أن الخلايا ملتصقة ومتفرعة قليلا باستخدام مجهر المجال الساطع بتباين الطور المقلوب. تخلص من الوسط الذي يحتوي على الخلايا غير الملتصقة. اغسل الخلايا باستخدام IMDM مرة واحدة وأضف 30 مل من وسط زراعة MCSF.
- عندما تنضج الخلايا بحلول اليوم 10 (>95٪ إيجابية ل F4 / 80 و Mac-1) ، تحقق مرة أخرى من أن الخلايا ملتصقة وقليلا.
- لصفيحة الخلايا للتحفيز ، قم بإزالة وسط الثقافة من القارورة وأضف 8 مل من المخزن المؤقت لتفكك الخلايا الخالي من الإنزيم والقائم على EDTA (جدول المواد). احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2.
- اكشط الخلايا برفق ، مع كمية صغيرة من الضغط ، باستخدام مكشطة خلية معقمة. تحقق في المجهر من انفصال الخلايا عن سطح القارورة. قامت الماصة بفصل الخلايا إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. اشطف القارورة 3 مرات باستخدام 5 مل من IMDM وقم بتجميع محلول الشطف مع الخلايا التي تم حصادها. خلايا الطرد المركزي عند 300 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- أعد تعليق حبيبات الخلية في 3 مل من وسط ثقافة MCSF لكل 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام مقياس كثافة الدم. أعد تعليق الخلايا بتركيز 1 × 106 خلايا / مل ولوحة 100 ميكرولتر من تعليق الخلية (1 × 105 خلايا / بئر) لكل بئر من 96 بئر ، مزرعة أنسجة معالجة ، لوحة مسطحة ><القاع.
ملاحظه: ستولد عظام فأر واحد خلايا كافية ل 100 بئر. إذا رغبت في ذلك ، يمكن طلاء 1 مل من الخلايا في صفيحة من 6 آبار (معالجة زراعة الأنسجة ، قاع مسطح). قد يكون عدد أكبر من الخلايا (1 × 106 خلايا) مفيدا لتحليلات اللطخة الغربية.
- بمجرد الالتصاق ، قم بتحفيز الآبار المكررة أو الثلاثية لكل منها 10 نانوغرام / مل من LPS في IMDM ، أو 30 مجم / مل من IVIg ، أو IVIg + LPS. يمكن معايرة جرعات LPS أو IVIg لتحسين الاستجابات. اترك الآبار المكررة أو الثلاثية كعناصر تحكم غير محفزة. احتضنها لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2).
ملاحظه: يجب أن تلتصق الخلايا المعاد طلاؤها بآبار زراعة الأنسجة في غضون 1 ساعة.
- اجمع المواد الطافية الخلوية من كل بئر في أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.7 مل وقم بإزالة أي جسيمات عن طريق الدوران عند 10,000 × جم لمدة 5 دقائق.
- قم بإزالة المادة الطافية للخلية وتجنب إزعاج الحبيبات. ضع المادة الطافية للخلية المصفاة في أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق.
ملاحظه: يمكن فحص المواد الطافية للخلايا للسيتوكينات ، IL-10 ، والوحدة الفرعية للسيتوكين ، IL-12 / 23p40 ، عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) على الفور أو تخزينها عند -80 درجة مئوية على المدى الطويل. اتبع بروتوكول ELISA من مجموعة متوفرة تجاريا (جدول المواد). يمكن فحص السيتوكينات الأخرى المؤيدة للالتهابات ، مثل IL-6 و TNF ، حيث يتم تقليلها أيضا عن طريق العلاج المشترك مع تحفيز IVIg + LPS مقارنة بالتحفيز باستخدام LPS وحده. بعد التحفيز ، يمكن تحضير الخلايا الملتصقة لتقنيات مثل النشاف الغربي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (Q-PCR).