تنشيط في الجسم الحي للبلاعم البريتونية استجابة للأجسام المضادة في نموذج الفئران

الملخص

المصدر: Kozicky، L.، et al.، تقييم تأثيرات الأدوية القائمة على الأجسام المضادة على نخاع عظم الفئران وتنشيط البلاعم الصفاقية.J. Vis. Exp. (2017)

يوضح هذا الفيديو تنشيط البلاعم البريتونية للفأر باستخدام الغلوبولين المناعي الوريدي وعديد السكاريد الدهني البكتيري. ينشط التحفيز المشترك البلاعم البريتونية إلى ضامة مضادة للالتهابات تمتلك نشاطا تنظيميا مناعيا.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحدي الفئران في الجسم الحي مع الغلوبولين المناعي الوريدي وعديد السكاريد الدهني (IVIg + LPS) وحصاد البلاعم البريتونية

1. وزن كل فأر. احسب حجم IVIg (تركيز مخزون 100 مجم / مل) اللازم لتوفير جرعة نهائية تبلغ 2.5 جم / كجم من وزن الجسم. احسب كمية LPS (تركيز مخزون 100 ميكروغرام / مل في وسط Dulbecco المعدل (IMDM)) من Iscove) المطلوب لتوفير جرعة نهائية تبلغ 0.2 ميكروغرام / غرام من وزن الجسم.
   ملاحظه: على سبيل المثال ، بالنسبة للماوس 20 جم ، يلزم 500 ميكرولتر من محلول مخزون IVIg و 40 ميكرولتر من محلول 100 ميكروغرام / مل من LPS.
2. اسحب الكمية المطلوبة من IVIg و LPS في حقنة معقمة سعة 1 مل مزودة بإبرة معقمة قياس 26. بالنسبة للفئران الضابطة التي لن تتلقى IVIg ، استبدل حجما مكافئا من IVIg بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات (PBS) درجة الحموضة 7.4.
قم
3. بتقطيع الماوس بيد واحدة عن طريق الإمساك بجلده في مؤخرة العنق بإصبعك والإبهام والسبابة وإمساك ذيله وساقيه الخلفيتين بأصابعك المتبقية. قم بإمالة جسمه نحو الأرض.
4. ضع الإبرة بزاوية 30 - 40 درجة بالنسبة لبطن الماوس ، في الربع الأيمن السفلي ، وقم بشطفها ، وأدخل 1.5 سم. قم بحقن IVIg + LPS ، أو PBS + LPS ، داخل الصفاق.
5. بعد 1 ساعة ، قم بإجراء القتل الرحيم باستخدام ثاني أكسيد الكربون (CO₂) الاختناق.
   1. ضع الماوس في غرفة الحث. قتل الفأر بتخدير إيزوفلوران بنسبة 5٪ ، لمدة 60 - 90 ثانية ، حتى يصبح التنفس عميقا وبطيئا.
   2. قم بإيقاف تخدير الأيزوفلوران وقم بإعطاء 6-8 لتر / دقيقة من ثاني أكسيد الكربون₂ حتى يتوقف الفأر عن التنفس. اترك الماوس مع ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 5 دقائق أخرى على الأقل. تحقق من عدم وجود نبضات قلب أو تنفس. إجراء خلع عنق الرحم لضمان الوفاة.
      ملاحظة: توفر الفئران التي يبلغ عمرها 8-12 أسبوعا أعلى إنتاجية من الضامة.
6. قم بتثبيت الماوس على لوح رغوي ، مع انتشار الأطراف. رش الأجزاء بنسبة 70٪ من الإيثانول.
   ملاحظه: قم بتنفيذ الإجراء في غطاء معقم.
7. قم بعمل قطع ضحل في الجلد (0.2 سم) بمقص على طول خط الوسط للماوس ، لتجنب قطع التجويف البريتوني. اسحب جلد البطن من بطن الفأر باستخدام الملقط ، بحيث تكون بطانة الجدار البريتوني السليم مرئية.
8. املأ حقنة سعة 5 مل ب 5 مل من PBS المعقم (الرقم الهيدروجيني 7.4). أدخل إبرة قياس 25 أو 27 في الجزء العلوي من التجويف من الجانب الأيسر أو الأيمن باتجاه مركز الماوس مع وضع شطبة الإبرة لأعلى.
   ملاحظه: ضع الإبرة بعناية في الماوس حتى لا تحقن PBS في الأعضاء ، بل في الفضاء البريتوني.
9. ادفع السائل إلى التجويف البريتوني. اسحب الإبرة من التجويف ودلك الصفاق لمدة 10 ثوان لإخراج أي خلايا. أدخل الإبرة في الجزء العلوي من التجويف وتجنب الأعضاء. اجمع ووضع سائل الغسيل المستعاد في أنبوب مخروطي سعة 15 مل على الثلج.
   ملاحظه: لكل 5 مل من السوائل المحقونة ، سيتم استرداد ما يقرب من 3.75 مل.
10. كرر الحقن والتعافي (الخطوات 1.8 - 1.9) 3 مرات أخرى (إجمالي حجم الحقن 20 مل) ، لاستعادة 15 مل من سائل الغسيل في المجموع. اجمع الغسيل من كل فأر في أنبوب مخروطي منفصل سعة 15 مل.
    ملاحظه: بعد الحقن النهائي ، قد يكون من الأسهل استخراج السائل من أقصى الجانبين الأيسر والأيمن من الفأر ، حيث يتراكم السوائل. سوف تسبب الأعضاء تداخلا أقل مع الإبرة في هذا الموضع.
11. قم بتدوير الخلايا عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة 1 مل من سائل الغسيل المستعاد واستخدمه في تحليلات الإنترلوكين أو IL-10 و IL-12 / 23p40 عن طريق مقايسة الممتز المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة أو قم بالتجميد عند -80 درجة مئوية للتحليلات المستقبلية.
    ملاحظه: لضمان المقارنة الدقيقة بين علاجات تحليل السيتوكين السائل الغسيل ، قم بإجراء 5 مل من التجويف البريتوني 4 مرات للحصول على حجم نهائي يبلغ 15 مل. لن يتم استرداد كل السوائل من كل تدفق.
12. أعد تعليق الخلايا في 500 ميكرولتر من وسط الطلاء (IMDM ، مصل بقري الجنين 10٪ ، FBS ، و 100 وحدة / مل بنسلين / ستربتومايسين) لكل فأر مغشوش. عد البلاعم القابلة للحياة.
    ملاحظه: ستكون الضامة أكبر قليلا من الخلايا البريتونية الأخرى. العائد النموذجي هو 5 × 10⁵ - 1 × 10⁶ ضامة / ماوس باستخدام ماوس C57BL / 6 من النوع البري.
    اختياري: في حالة وجود عدد كبير من خلايا الدم الحمراء في حبيبات الخلية ، قم بإجراء خطوة التحلل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة لإزالتها.
13. أعد تعليق الخلايا في وسط الطلاء عند 1 × 10⁶ بلاعم / مل ولوحة 100 ميكرولتر لكل بئر في لوحة معالجة بثقافة الأنسجة ذات القاع المسطح 96 بئر. < / > ملاحظه: قد يكون من الضروري تجميع الخلايا من أكثر من فأر واحد لإجراء تجربة. على سبيل المثال ، إذا كان لدى فأر واحد 5 × 10⁵ ضامة ، فستكون هناك حاجة إلى 500 ميكرولتر من وسط الطلاء.
14. احتضان الخلايا لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ للسماح للبلاعم بالالتصاق. الخلايا الملتصقة هي الضامة الصفاقية. إزالة الخلايا الطافية والخلايا غير الملتصقة. اشطف الآبار مرتين باستخدام 200 ميكرولتر IMDM (دافئ مسبقا إلى 37 درجة مئوية) ، وانتظر لمدة 10 ثوان ، وقم بإمالة اللوحة ببطء. استبدل وسط الطلاء. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 30 دقيقة قبل التحفيز.
15. بمجرد الالتصاق ، قم بتحفيز الآبار المكررة أو الثلاثية لكل منها 10 نانوغرام / مل من LPS في IMDM ، أو 30 مجم / مل من IVIg ، أو IVIg + LPS. يمكن معايرة جرعات LPS أو IVIg لتحسين الاستجابات. اترك الآبار المكررة أو الثلاثية كعناصر تحكم غير محفزة. احتضنها لمدة 24 ساعة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}).
    ملاحظه: يجب أن تلتصق الخلايا المعاد طلاؤها بآبار زراعة الأنسجة في غضون 1 ساعة. يمكن استخدام العينات على الفور أو تجميدها وتخزينها عند -80 درجة مئوية لتحليل السيتوكين بواسطة ELISA.
16. اجمع المواد الطافية الخلوية من كل بئر في أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.7 مل وقم بإزالة أي جسيمات عن طريق الدوران عند 10,000 × جم لمدة 5 دقائق.
17. قم بإزالة المادة الطافية للخلية وتجنب إزعاج الحبيبات. ضع المادة الطافية للخلية المصفاة في أنبوب معقم للطرد المركزي الدقيق.
    ملاحظه: يمكن فحص المواد الطافية للخلايا للسيتوكينات ، IL-10 ، والوحدة الفرعية للسيتوكين ، IL-12 / 23p40 ، بواسطة ELISA على الفور ، أو تخزينها عند -80 درجة مئوية على المدى الطويل. اتبع بروتوكول ELISA من المجموعة المتوفرة تجاريا (جدول المواد). يمكن فحص السيتوكينات الأخرى المؤيدة للالتهابات ، مثل IL-6 وعامل نخر الورم (TNF) ، حيث يتم تقليلها أيضا عن طريق العلاج المشترك مع تحفيز IVIg + LPS مقارنة بالتحفيز باستخدام LPS وحده. بعد التحفيز ، يمكن تحضير الخلايا الملتصقة لتقنيات مثل النشاف الغربي أو تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (Q-PCR).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات وسيط Dulbecco المعدل من Iscove (IMDM) تقنيات الحياة 12440053 مصل الأبقار الجنينية (FBS) تقنيات الحياة هاتف: 12483-020 البنسلين - ستربتومايسين تقنيات الحياة 15140148 1X مخزن مؤقت لتحلل خلايا الدم الحمراء العلوم البيولوجية الإلكترونية المخزن المؤقت لتفكك الخلايا تقنيات الحياة 13150016 خال من الإنزيم ، قائم على هانكس ، EDTA عديد السكاريد الدهني (LPS) سيجما ألدريتش ل 4516 من الإشريكية القولونية 0127: B8 IVIg (Gammunex) Grifols تم استلامها من مستشفى كولومبيا البريطانية للأطفال ، طب نقل الدم IVIg (سائل Gammagard) شركة باكستر للرعاية الصحية تم استلامها من مستشفى كولومبيا البريطانية للأطفال ، طب نقل الدم IVIg (ثماني) أوكتافارما تم استلامها من مستشفى كولومبيا البريطانية للأطفال ، طب نقل الدم محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) (معقم) ، درجة الحموضة 7.4 تقنيات الحياة 10010023 ماوس IL-10 ELISA BD العلوم البيولوجية 555252 ماوس IL-12 / 23p40 ELISA BD العلوم البيولوجية 555165 26 جرام إبرة BD العلوم البيولوجية 305110 1 مل حقنة BD العلوم البيولوجية 309659 حقنة 10 مل BD العلوم البيولوجية 309604 15 مل أنبوب مخروطي BD العلوم البيولوجية 352096 ملقط VWR 82027-386 طرف ناعم ، تشريح مقص VWR 82027-582 حساسة ، 4 1/2 " مجهر برايتفيلد موتيك طر31 تباين الطور المقلوب مِيزَان ميتلر PE 3000