تقييم المناعة التي يسببها اللقاح ضد العدوى البكتيرية في نموذج الفأر

الملخص

المصدر: Caution, K., et al. تقييم استجابات مسببات الأمراض المضيفة وفعالية اللقاح في الفئران. J. Vis. Exp. (2019).

في هذا الفيديو ، نصف بروتوكولا لاختبار فعالية لقاح السعال الديكي اللاخلوي ضد عدوى السعال الديكي في الفئران. بعد التطعيم ، تعرضت الفئران للعدوى ، وتم زراعة أنسجتها متجانسة لتحليل المستعمرات البكتيرية كقراءة للمناعة الوقائية التي يسببها اللقاح.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحصين الفئران

1. تحضير مزيج لقاح رئيسي في مخزن فسيولوجي معقم مثل محلول ملحي أو DPS.
   ملاحظه: وينبغي أن يشمل الحجم الإجمالي في المزيج 10٪ أكثر من الحجم المطلوب لتحصين المجموعة بأكملها. وترد أدناه تفاصيل تركيزات تركيبة اللقاح في الخطوتين 1-1-1 و1-1-2. انقل العناصر إلى vivarium على الجليد.
   1. بالنسبة لدراسات B. السعال الديكي ، قم بتضمين مجموعات اللقاحات التالية: لقاح السعال الديكي اللاخلوي (aPV) وعامل استعمار aPV + Bordetella A (BcfA). بالإضافة إلى ذلك ، استخدم الشب ومستضدات اللقاح وحدها (الهيماجلوتينين الخيطي (FHA) ، والبيرتاكتتين (Prn)) ، والفئران الساذجة (غير المحصنة) كمجموعات تحكم.
      ملاحظة: aPV هو 1/5^{ثان الجرعة} البشرية من aPV المعتمد من إدارة الغذاء والدواء الأمريكية ، والذي يتكون من ذيفان الكزاز ، وذيفان الدفتيريا المخفض ، وذيفان السعال الديكي (PT) ، والهيماجلوتينين الخيطي (FHA) ، والبيرتاكتتين (Prn) الممتزة إلى أملاح الألومنيوم. جرعة بشرية واحدة من السعال الديكي الحالي aPV هي 0.5 مل ، وبالتالي ، فإن 1/^{5 من} الجرعة هي 0.1 مل. أحجام aPV + BcfA هي 0.1 مل من aPV (1/5^الجرعة البشرية) + 0.046 مل من BcfA (30 ميكروجرام) لكل فأر. الحد الأقصى للحجم الذي يمكن توصيله بأمان إلى عضلة واحدة هو 0.1 مل. نظرا لأن حجم لقاح aPV + BcfA أكبر من 0.1 مل ، يجب تسليم اللقاح إلى كلا الكتفين ، مقسمة بالتساوي تقريبا ، من أجل إعطاؤه بأمان.
   2. لتحضير لقاح تجريبي ، لجرعة واحدة ، امزج 1 ميكروغرام من FHA و 0.5 ميكروغرام من Prn مع 50 ميكروغرام من هلام هيدروكسيد الألومنيوم في PBS المعقم. اسمح للكهروضوئية التجريبية بالاختلاط على أسطوانة المختبر لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT). بعد ذلك ، قم بتدوير الأنبوب عند 18,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق المحتويات في 1 مل من PBS المعقم.
2. في vivarium ، قم بإعداد آلة التخدير (الشكل 1).
   ملاحظه: تأكد من وجود مستويات كافية من الأكسجين والأيزوفلوران في خزانات كل منهما قبل الاستخدام. قم بوزن علبة زبال الأيزوفلوران واستبدلها عندما يزيد وزنها بمقدار 50 جم.
3. قم بتنظيف خزانة السلامة البيولوجية (BSC) جيدا وضع غرفة الحث النظيفة داخل BSC. قم بتوصيل خطوط التخدير والزبال من آلة التخدير بغرفة الحث. افتح خزان الأكسجين عبر المنظم للتأكد من تدفق الأكسجين واضبط المستوى على 1.5-2 لتر / دقيقة.
4. ضع الفئران في العمر المطلوب (6-12 أسبوعا) في غرفة الحث. قم بتشغيل الأيزوفلوران إلى 2.5-3٪ لتخدير الفئران برفق. راقب حتى لا تتحرك في الغرفة ويتباطأ تنفسها.
5. اختبر مستوى الحث عن طريق الضغط على أصابع القدم ، مع ملاحظة أي حركة انعكاسية. إذا لم يكن هناك أي شيء ، فإن الفئران جاهزة للحقن.
   ملاحظة: في هذه التجربة ، تم تخدير قفص بالكامل في الحال. يمكن للمرء أن يختار تخدير بشكل فردي للحقن أو حقن بدون تخدير. أي من هاتين الطريقتين مناسبة.
6. وفي الوقت نفسه ، قم بإعداد 1 مل من محاقن الأنسولين (28G1 / 2) مع 0.1 مل من اللقاح لكل منها. عندما يتم تحفيز بالكامل ، قم بإزالة واحد من الغرفة وضع الفأر بطنيا على منشفة أو وسادة مقعد.
7. يجب تطبيق اللقاح عن طريق الحقن العضلي. مع وجود المحقنة بزاوية 45 درجة ومع توجيه الشطبة لأعلى ، أدخل المحقنة ~ 5 مم في الدالية للفأر وحقن اللقاح.
   ملاحظه: يمكن استخدام الربع الخلفي / الجناح كموقع حقن بدلا من الدالية.
8. بعد الحقن ، احتفظ بالإبرة التي يتم إدخالها في العضلات لمدة ~ 5-10 ثوان. بمجرد تسليم الحجم ، قم بتدوير المحقنة عند 180 درجة بحيث يكون الشطبة متجها بعيدا لإنشاء ختم ومنع تسرب اللقاح. ثم اسحب الإبرة ببطء من موقع الحقن.
9. أعد الماوس إلى القفص. كرر الإجراء مع جميع في المجموعة المحددة.
10. قم بإيقاف تشغيل الأيزوفلوران وغسل غرفة الحث بالأكسجين قبل تخدير القفص التالي من الفئران.
11. راقب حتى تصبح جميعا في حالة تأهب وتتحرك في القفص. أعد القفص إلى موقع السكن.
12. راقب كل 12 ساعة بعد التطعيم ، حتى 48 ساعة ، بحثا عن الأعراض السريرية للمراضة مثل المعطف الخشن / غير المهذب أو المشي البطيء أو صعوبة التنفس. إذا استمرت الأعراض ، فاستشر الطبيب البيطري المؤسسي ، وقم بإزالة الفئران من الدراسة إذا لزم الأمر.
13. بعد أربعة أسابيع من التحصين الأولي ، عزز الفئران عن طريق تخدير وإعطاء الحقن العضلي في الدالية اليمنى للفأر بنفس تركيبة اللقاح التي تم إعطاؤها سابقا.
14. مرة أخرى ، راقب بحثا عن أي أعراض سريرية. المنزلية لمدة أسبوعين إضافيين ثم المضي قدما في العدوى.

< p class = "jove_title" >2. نموذج عدوى الفئران داخل الأنف

1. في الحشاء ، اضبط ظروف الأكسجين والتخدير كما هو موضح في الخطوتين 1.3 و 1.4. كما هو موضح في الخطوة 1.5 ، ضع الفئران في الغرفة للتخدير. راقب حتى يصبح التخدير ساري المفعول.
2. عندما يتم تخدير الفئران ، قم بإزالة واحد في كل مرة من غرفة الحث. التقط الفأر من قفص الصدر الظهري ، خلف لوحي الكتف والرقبة. ضع الماوس في وضع مستقيم للوصول إلى الأنف.
3. باستخدام طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر ، ضع ببطء 40-50 ميكرولتر من لقاح بكتيري B. السعال الديكي على أنصاف الفأر (20-25 ميكرولتر في كل صحي). امسك الفأر حتى يستنشق اللقاح بالكامل. إذا خرجت بعض اللقاح فقاعات ، اجمع الفقاعات وأعد غرسها في القذائف. قم بتوصيل كمية متساوية من PBS المعقم لمجموعة واحدة من الفئران كعنصر تحكم سلبي.
4. كما هو الحال في الخطوات 1.10-1.12 ، أعد الملقحة إلى قفصها وراقب حتى تكون في حالة تأهب وتتحرك. أعد القفص إلى مساحة السكن الأصلية على الرف. اغسل غرفة الحث بالأكسجين لإزالة الأيزوفلوران المتبقي قبل تخدير المجموعة التالية من. راقب لمدة 48 ساعة بعد الإصابة.
5. في المختبر ، التخفيفات التسلسلية للقاح ، في PBS المعقمة ، للتحقق من وحدات تشكيل المستعمرة الفعلية (CFUs) التي يتم تسليمها إلى الفئران. صفيحة 0.1 مل من التخفيفات على ألواح BG + Sm بنسبة 10٪ (صفائح أجار Bordet-Gengou مكملة بنسبة 10٪ من دم الأغنام منزوع الرجفان و 100 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين) (الشكل 2 أ). ضع الألواح في حاضنة 37 درجة مئوية وتنمو لمدة 4 أيام. عد واحسب وحدات التشكيل المتكامل من اللقاح الذي تم تسليمه إلى الماوس (الشكل 2 ب).

< p class = "jove_title" >3. حصاد الأنسجة الحيوانية بعد الإصابة

1. استعد لتشريح الفئران وحصاد الأنسجة.
   1. تعقيم جميع الأدوات (المقص الخشن والناعم ، والمقص المنحني ، والملقط الناعم ، ومدقات الحبيبات ، وموزعات المثلث) اللازمة لمعالجة الأنسجة في الأوتوكلاف. ختم الأدوات في أكياس التعقيم. لف المجانسات الزجاجية بورق الألمنيوم وأضف شريط الأوتوكلاف للإشارة إلى العقم.
   2. قم بإعداد ألواح أجار قبل 1 أو 2 أيام من حصاد الأنسجة للتأكد من أن الألواح قد تم ترسيخها قبل الاستخدام. بالنسبة إلى B. السعال الديكي ، استخدم 10٪ BG + Sm. لوحات ملصقات للرئة لكل فأر مع التخفيفات المرغوبة ، يتم تحديدها تجريبيا لكل تجربة.
   3. ملء ووضع ملصقات أنابيب تخفيف CFU. أضف 0.9 مل من PBS المعقم إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المعقمة سعة 1.5 مل بناء على عدد الأعضاء المراد معالجتها والتخفيفات لكل عضو.
   4. تعبئة ووضع العلامات على الأنابيب لجمع الأنسجة:
      1. الرئتين: أضف 2 مل من الكازين المعقم 1٪ في PBS إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مل وتخزينه عند 4 درجات مئوية. لحصاد الرئتين من أجل الأنسجة ، أضف 2 مل من الفورمالين المحايد 10٪ (NBF) وقم بتخزينه في RT.
   5. يجب تحضير 70٪ من الإيثانول الطازج لملء الأكواب وزجاجات الرش للتشريح.
2. انقل جميع المواد إلى vivarium على عربة في يوم الحصاد. قم بتنظيف BSC وإعداد جهاز التخدير كما في الخطوتين 1.3 و 1.4.
3. ضع الفئران المراد تشريحها في غرفة الحث ، ومع تدفق الأكسجين ، قم بتشغيل الأيزوفلوران إلى 5٪ وانتظر حتى تفقد الوعي. قم بإزالة الفئران واحدة تلو الأخرى ، وخلع عنق الرحم كطريقة ثانوية لضمان الموت. بعد خلع عنق الرحم ، يجب تأكيد القتل الرحيم من خلال عدم وجود معدل تنفس و / أو غياب منعكس الانسحاب (اختبار قرصة إصبع القدم).
4. ضع الماوس ، والجانب البطني متجها لأعلى ، على لوحة التشريح وقم بتثبيت الذراعين والساقين مفتوحين. رش جسم الفأر بنسبة 70٪ من الإيثانول.
5. باستخدام الملقط ، قم بتثبيت الجلد تحت البطن ، في وسط الحوض. باستخدام مقص حاد ، قم بعمل قطع رأسي حتى الفك السفلي. بعد ذلك ، قم بتشريح الجلد بعيدا عن الجدار البريتوني عن طريق دفع الطبقتين بعيدا عن بعضهما البعض ، باستخدام حركات صغيرة مع إغلاق المقص. ضع الجلد على جانبي الذبيحة لإنشاء حقل خال من العوائق لحصاد الأعضاء المعقمة.
6. استخدم الملقط لتثبيت القفص الصدري في عملية الخنجري وقطع الحجاب الحاجز. يجب أن تنكمش الرئتان وتسقط باتجاه العمود الفقري. اقطع القفص الصدري من الجانبين لإزالة درع الصدر.
7. عزل وإزالة الفص العلوي للرئة اليمنى ، وقطع الشرايين والأوردة الرئوية. ضع الفص في أنبوب مخروطي 15 مل يحتوي على 10٪ NBF وضع الأنبوب في RT لمدة 24 ساعة على الأقل لإصلاح الأنسجة. اعزل الفصوص المتبقية من الرئة اليمنى والرئة اليسرى. ضع الفصوص في أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 2 مل من الكازين 1٪ في PBS وضعه على الثلج.
8. تخلص من الذبيحة في كيس بيولوجي. قبل تشريح التالي ، اشطف الأدوات بالماء منزوع الأيونات ، ثم ضعها في دورق مملوء بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بإزالة الأدوات ، وتخلص من الإيثانول الزائد ، ثم تابع التشريح التالي.
9. قم بتشريح كل فأر باتباع الخطوات المذكورة أعلاه.
10. قم بمعالجة الأنسجة كما هو موضح أدناه.

< p class = "jove_title" >4. معالجة الرئتين

1. نقل الرئتين (في 2 مل من 1٪ كازين في PBS) إلى خالط معقم 15 مل Dounce. استخدم مدقة لتجانس الأنسجة. انفصال حتى لا تبقى جزيئات كبيرة من الأنسجة. ضع المعلق المتجانس مرة أخرى في الأنبوب الأصلي سعة 15 مل.
2. قم بإزالة كمية 0.3 مل لطلاء CFUs والطرد المركزي المتجانس عند 450 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. اجمع المادة الطافية وقم بتقطيعها في حصص 0.5 مل في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة المسماة مسبقا. قم بتخزين العينات عند -20 درجة مئوية حتى تحليل السيتوكينات بواسطة ELISA.
3. قم بإعداد التخفيفات المختارة عن طريق التخفيف المتسلسل 0.1 مل من معلق الرئة المتجانس في أنابيب التخفيف (0.9 مل من PBS المعقم). ضعي 0.1 مل من التخفيفات المختارة تجريبيا على ألواح BG + Sm المسماة مسبقا وانتشرها باستخدام موزعة مثلثة معقمة.
4. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية في هواء الغرفة لمدة 4 أيام.
5. عد وحساب CFUs / الرئة (الشكل 3). باختصار ، اضرب أرقام CFU المستردة في عامل تخفيف اللوحة ، ثم أيضا بالحجم الكلي الذي تمت معالجة العضو فيه. ثم يتم تحويل حسابات CFU إلى قيم Log₁₀ لكل ورسمها بيانيا.
   1. يتم حساب اللوحات التي تحتوي على 30-300 مستعمرة بسهولة ودقة. لا ينبغي استخدام الألواح التي تحتوي على أقل من 6 مستعمرات للحسابات لأن أعداد المستعمرات المنخفضة هذه تسبب أخطاء. للحصول على حد أدنى للكشف ، يتم تقسيم الحجم الكلي الذي تم تجانس العضو فيه على الحجم المستخدم للبقعة على صفيحة من المتجانس غير المخفف (على سبيل المثال ، الحجم الكلي 2 مل مقسوما على 0.1 مل من المتجانس غير المخفف يساوي الحد الأدنى ل 20 CFUs التي يمكن اكتشافها).

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: إعداد آلة التخدير. يظهر مبخر مخدر مع غرفة حث متصلة ونظام زبال (داخل خزانة السلامة البيولوجية).

< p class = "jove_content" >
الشكل 2: حساب اللقاح داخل الأنف. (أ) تخطيطي للتخفيف التسلسلي للقاح العدوى المخفف إلى ^10-4 و ^10-5 و ^10-6. يتم طلاء هذه التخفيفات عل...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات غرفة الحث 2 لتر تجهيز الطبيب البيطري 941444 فلوريسو طبيب بيطري واحد V1 501017 أي علامة تجارية مناسبة الكازين سيغما سي -7078 قاعدة بورديت جينجو أجار BD العلوم الحيوية هاتف: 248200 الأدوات - مقص ، مقص منحنى ، ملقط ، ملقط دقيق ، موزعات مثلثات أي علامة تجارية مناسبة 15 مل طاحونة مناديل ويتون 357544 أي علامة تجارية مماثلة مناسبة الخالط اليدوي اللاسلكي كونتيس / سيجما Z359971-1EA أي علامة تجارية مماثلة مناسبة محاقن 3 مل BD العلوم الحيوية 309657 15 مل أنابيب مخروطية صياد 339651 1.5 مل أنابيب الطرد الدقيق دينفيل سي 2170 1 مل حقنة أنسولين 28G1 / 2 فيشر ساينتفيك / إكسل إنت. 14-841-31