ديناميكيات العضيات في الخلايا الليمفاوية البائية بعد التنشيط باستخدام حبيبات مغلفة بالمستضد

الملخص

المصدر: Ibañez-Vega، J.، et al.، دراسة ديناميكيات العضية في الخلايا البائية أثناء تكوين المشبك المناعي. J. Vis. Exp. (2019)

في هذا الفيديو ، نصف طريقة لدراسة ديناميكيات العضيات في الخلايا الليمفاوية البائية بعد تنشيطها باستخدام الميكروبيدات المغلفة بالمستضد.

البروتوكول

ملاحظة: تم تنفيذ الخطوات التالية باستخدام خلايا IIA1.6 B.

فئة

1. تنشيط الخلايا البائية بالخرز المطلي بالمستضد

1. تحضير الخرز المطلي بالمستضد
   1. لتنشيط الخلايا البائية ، استخدم حبات NH_2-Seasons المغلفة تساهميا بمستضد (حبات مغلفة ب Ag) ، والتي يتم تحضيرها باستخدام 50 ميكرولتر (~ 20 × 10⁶ خرز) من 3 ميكرومتر NH_2-beads مع مستضدات منشطة (BCR-ligand +) أو غير منشطة (BCR-ligand-).
   2. بالنسبة ل IIA1.6 الخلايا البائية ، تستخدم الجزء المضاد ل IgG-F (ab') ₂ مثل BCR-ligand + ومضاد ل IgM-F (ab') ₂ أو ألبومين مصل البقر (BSA) ك BCR-ligand-. لتنشيط الخلايا البائية الأولية أو خط الخلايا IgM + B ، استخدم مضاد IgM-F (ab') ₂ ك BCR-ligand + و BSA ك BCR-ligand-.
      ملاحظه: لتجنب ارتباط الروابط بمستقبلات Fc ، استخدم شظايا الأجسام المضادة F (ab') أو F (ab _{') 2} بدلا من الأجسام المضادة كاملة الطول.
   3. للمضي قدما في تحضير الخرز المطلي ب Ag ، ضع الخرزات في أنابيب طرد مركزي دقيقة منخفضة البروتين لزيادة تعافي الخرزات أثناء معالجة العينة. أضف 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) لغسل الخرز وأجهزة الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 5 دقائق. شفط المادة الطافية.
   4. أعد تعليق الخرزات ب 500 ميكرولتر من 8٪ جلوتارالديهايد لتنشيط مجموعات NH₂ وتدويرها لمدة 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة (RT).
      أنذر: يجب استخدام محلول مخزون الجلوتارالديهايد فقط في غطاء الدخان الكيميائي. اتبع التعليمات الموجودة على ورقة بيانات سلامة المواد (MSDS).
   5. حبات الطرد المركزي عند 16,000 × جم لمدة 5 دقائق ، قم بإزالة الجلوتارالديهايد ، واغسل الخرزات ثلاث مرات أخرى باستخدام 1 مل من 1x PBS.
      أنذر: يجب التخلص من محلول الجلوتارالديهايد كنفايات كيميائية خطرة.
   6. أعد تعليق الخرزات المنشطة في 100 ميكرولتر من 1x PBS. يمكن تقسيم العينة إلى أنبوبين منخفضي البروتين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة: 50 ميكرولتر ل BCR-ligand + و 50 ميكرولتر ل BCR-ligand-.
   7. لتحضير محلول المستضد ، استخدم أنبوبين من أجهزة الطرد المركزي الدقيقة منخفضة البروتين سعة 2 مل تحتوي على 100 ميكروغرام / مل من محلول المستضد في 150 ميكرولتر من PBS: أنبوب واحد مع BCR-ligand + والآخر مع BCR-ligand-.
   8. أضف 50 ميكرولتر من محلول الخرز المنشط إلى كل أنبوب يحتوي على 150 ميكرولتر من محلول المستضد ، الدوامة ، وقم بالتدوير طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
   9. أضف 500 ميكرولتر من 10 مجم / مل BSA لمنع مجموعات NH₂ التفاعلية المتبقية على الخرزات وتدويرها لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية.
   قم
   10. بالطرد المركزي للحبات عند 16,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية وقم بإزالة المادة الطافية. اغسل الخرزات ب 1x PBS البارد ثلاث مرات أخرى.
   11. أعد تعليق الخرزات المنشطة في 70 ميكرولتر من 1x PBS.
   12. لتحديد التركيز النهائي للحبات المطلية ب Ag ، قم بتخفيف كمية صغيرة من الخرز في PBS (1: 200) وقم بالعد باستخدام مقياس كثافة الدم. ثم يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
       ملاحظه: لا ينبغي تخزين الخرز المطلي ب Ag لأكثر من 1 شهر.

فئة < ص = "jove_title" >2. تحضير أغطية بولي إل ليسين

1. قبل مقايسة تنشيط الخلايا البائية باستخدام الخرز المطلي ب Ag ، قم بإعداد أغطية مطلية ب poly-L-lysine (PLL-coverslips). استخدم أنبوبا سعة 50 مل يحتوي على 40 مل من 0.01٪ وزن / حجم من محلول PLL واغمر الغطاء الذي يبلغ قطره 12 مم في المحلول. قم بالتدوير بين عشية وضحاها في RT.
2. اغسل الغطاء باستخدام 1x PBS واتركه ليجف على غطاء لوح مكون من 24 بئرا مغطى بغشاء البارافين. تابع تنشيط الخلايا البائية.

3. تنشيط الخلية البائية

1. لبدء تنشيط الخلايا البائية بالخرز ، قم أولا بتخفيف خط الخلايا IIA1.6 B إلى 1.5 × 10⁶ خلايا / مل في وسط CLICK (RPMI-1640 مكمل ب 2 ملي L-Alanine-L-Glutamine + 55 ميكرومتر بيتا ميركابتو إيثانول + 1 ملي بيروفات + 100 وحدة / مل بنسلين + 100 ميكروغرام / مل ستربتومايسين) + 5٪ مصل بقري جنين معطل بالحرارة [FBS]).
2. اجمع بين 100 ميكرولتر (150,000 خلية) من خلايا IIA1.6 B مع حبات مغلفة ب Ag بنسبة 1: 1 في أنابيب 0.6 مل. تخلط برفق باستخدام دوامة والبذور على أغطية PLL. احتضان لنقاط زمنية مختلفة في حاضنة زراعة الخلايا (37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}). النقاط الزمنية النموذجية للتنشيط هي 0 و 30 و 60 و 120 دقيقة. بالنسبة للوقت 0 ، ضع غطاء PLL في غطاء اللوحة المكون من 24 بئرا على الجليد. يضاف خليط الخرز المطلي بالخلايا ويحتضن لمدة 5 دقائق على الثلج.
   ملاحظه: من المهم الخلط عن طريق الدوامة بدلا من سحب العينات لأعلى ولأسفل لأن هذا قد يقلل من عدد الخرزات في العينة ، بسبب تراكمها في الطرف البلاستيكي للماصة. استخدم الخرز المطلي ب BCR-ligand- كعنصر تحكم سلبي لكل فحص. نوصي بتنشيط أطول وقت حضانة أولا ثم النقاط الزمنية التالية. احسب فترات التنشيط للعينات بحيث تكون جاهزة للتثبيت في نفس الوقت.
3. أضف 100 ميكرولتر من 1x PBS البارد إلى كل غطاء لإيقاف التنشيط والاستمرار في بروتوكول التألق المناعي.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات IIA1.6 (متغير A20) خلايا لمفومة الفأر B ATCC TIB-208 سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الفئران من أصل Balb / c الذي يعبر عن BCR المحتوي على IgG على سطحه بدون FcγIIR 100٪ ميثانول فيشر ساينتيك أ 412-4 غطاء زجاج بقطر 10 مم ، سمك رقم 1 دائري مارينفيلد سوبيريور هاتف 111500 أمينو دينابيدز ثيرموفيشر 14307 د مضاد للبيرسنترين أبكام أب4448 يوصى بتخفيف 1: 200 ولكن يجب تحسينه مضاد للراب6 أبكام أب95954 يوصى بتخفيف 1: 200 ولكن يجب تحسينه مضاد للثانية 61 أبكام أب15575 يوصى بتخفيف 1: 200 ولكن يجب تحسينه جيش صرب البوسنه وينكلر بي إم -0150 الكريات المجهرية الأمينية Polybead 3.00μm العلوم المتعددة 17145-5 بولي L-يسين سيغما P8920 خفف بالماء المعقم RPMI-1640 الصناعات البيولوجية 01-104-1 أ تريتون X-100 ميرك 9036-19-5 أنبوب 50 مل كورنينج 353043