تنشيط الخلايا البائية على غطاء مغلف بالمستضد

الملخص

المصدر: Ibañez-Vega، J.، et al.، دراسة ديناميكيات العضية في الخلايا البائية أثناء تكوين المشبك المناعي. J. Vis. Exp. (2019)

يوضح هذا الفيديو تنشيط الخلية البائية في المختبر. تتضمن العملية تفاعل المستضد مع مستقبلات الخلايا البائية ، مما يؤدي إلى إعادة تشكيل الهيكل الخلوي ، وتكوين المشبك المناعي ، وحركة الليزوسوم ، واستيعاب المستضد ، والمعالجة ، والعرض اللاحق لجزيئات معقد التوافق النسيجي الكبير لتنشيط الخلايا البائية.

البروتوكول

فئة < ص = "jove_title" >1. تحضير أغطية بولي إل ليسين

1. قبل مقايسة تنشيط الخلايا البائية باستخدام الخرز المطلي ب Ag ، قم بإعداد أغطية مطلية ب poly-L-lysine (PLL-coverslips). استخدم أنبوبا سعة 50 مل يحتوي على 40 مل من 0.01٪ وزن / حجم من محلول PLL واغمر الغطاء الذي يبلغ قطره 12 مم في المحلول. قم بالتدوير بين عشية وضحاها في RT.
2. اغسل الغطاء باستخدام 1xPBS واتركه حتى يجف على غطاء لوح 24 بئرا مغطى بغشاء البارافين. تابع تنشيط الخلايا البائية.

فئة

2. تنشيط الخلايا البائية على أغطية مغلفة بالمستضد

1. تحضير أغطية مغلفة بالمستضد
   1. قبل التنشيط ، قم بإعداد محلول المستضد (1x PBS يحتوي على 10 ميكروغرام / مل BCR-ligand + و 0.5 ميكروغرام / مل من الفئران المضادة للفأر CD45R / B220).
   2. ملاحظة: ضع في اعتبارك إعداد أغطية الغطاء في اليوم السابق للفحص. يعمل B220 على تحسين التصاق الخلايا البائية ، ومع ذلك ، فإن BCR-Ligand + كاف لتوليد استجابة الانتشار.
   3. ضع الغطاء مقاس 12 مم على غطاء لوح سعة 24 بئرا مغطى بغشاء البارافين ، وأضف 40 ميكرولتر من محلول المستضد على كل غطاء ، واحتضنه عند 4 درجات مئوية طوال الليل. أغلق اللوحة لتجنب تبخر محلول المستضد.
   4. اغسل الغطاء باستخدام 1x PBS وجففه في الهواء.
2. تنشيط الخلية البائية
   1. لبدء التنشيط، قم بتخفيف خلايا IIA1.6 B إلى 1.5 × 10⁶ خلايا/مل في وسيط CLICK + 5٪ FBS.
   2. أضف 100 ميكرولتر من الخلايا إلى غطاء مغلف بالمستضد (Ag-coverslip) وقم بتنشيطه لنقاط زمنية مختلفة في حاضنة خلية عند 37 درجة مئوية / 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. النقاط الزمنية النموذجية للتنشيط هي 0 و 30 و 60 دقيقة
      ملاحظه: كما في القسم 1 ، نوصي بالبدء بأطول نقطة زمنية للتنشيط من أجل إصلاح جميع العينات في نفس الوقت.
   3. للوقت 0 ، ضع غطاء اللوحة المكون من 24 بئرا الذي يحتوي على غطاء Ag على الجليد وأضف الخلايا. احتضن لمدة 5 دقائق على الثلج.
   قم
   4. بشفط الوسائط بعناية على كل غطاء Ag ثم أضف 100 ميكرولتر من 1x PBS البارد لإيقاف التنشيط.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات IIA1.6 (متغير A20) خلايا لمفومة الفأر B ATCC TIB-208 سرطان الغدد الليمفاوية للخلايا البائية الفئران من أصل Balb / c الذي يعبر عن BCR المحتوي على IgG على سطحه بدون FcγIIR CaCl2 وينكلر كاليفورنيا -0520 جلايسين وينكلر بي إم -0820 HyClone مصل الأبقار الجنينية ثيرمو فيشر العلمي SH30071.03 قم بتعطيل الحرارة عند 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة كيه سي إل وينكلر ص.ب 1260 كلوريد الصوديوم وينكلر SO-1455 بارافيلم م ص 1150-2 البنسلين - ستربتومايسين ثيرمو فيشر العلمي 15140122 سائل بولي L-يسين سيغما P8920 خفف بالماء المعقم RPMI-1640 الصناعات البيولوجية 01-104-1 أ بيروفات الصوديوم ثيرمو فيشر العلمي 11360070 أنبوب 50 مل كورنينج 353043 2-ميركابتو إيثانول ثيرمو فيشر العلمي 21985023 الجلوتامين ثيرمو فيشر العلمي 35050061 جسم مضاد IgG مضاد للفأر جاكسون للأبحاث المناعية 315-005-003 الترابط الإيجابي IIA1.6