تأثير الجسم المضاد ل C-fms على تكوين العظم في خلايا نخاع عظم الفأر في المختبر

الملخص

المصدر: Marahleh, A., et al. تأثير الأجسام المضادة ل c-fms على تكوين ناقضات العظم وتكاثر سلائف ناقضات العظم في المختبر. J. Vis. Exp. (2019)

< p class = "jove_content">في هذا الفيديو ، نوضح تأثير تركيزات الأجسام المضادة المختلفة ل c-fms على تكوين العظم ، وهي عملية تكوين ناقضات العظم من أسلاف ناقضات العظم.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد BMM

1. بذرة 1 × 10⁷ خلايا / 10 مل في طبق استزراع 10 سم وأضف M-CSF 100 نانوغرام / مل. التركيز النهائي ل M-CSF هو 100 نانوغرام / مل من وسط الاستزراع. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 3 أيام.
2. بعد 3 أيام ، قم بإزالة وسط المزرعة ، واغسل الخلايا بقوة باستخدام 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) مرتين لإزالة الخلايا غير الملتصقة ، وأضف 5 مل من درجة حرارة الغرفة 0.02٪ تريبسين-EDTA في PBS ، واحتضن عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 5 دقائق.
3. افصل الخلايا عن طريق سحب العينة الشامل. تأكد من فصل الخلايا من خلال مراقبة المزرعة تحت المجهر (يجب أن تظهر الخلايا مستديرة وعائمة في الوسائط). إذا ظلت الخلايا متصلة، كرر سحب العينة جيدا لفصلها. عندما يتم فصل الخلايا ، أضف 5 مل من α-MEM لتعطيل التفاعل.
4. اجمع الخلايا في أنبوب مخروطي سعة 50 مل وجهاز طرد مركزي بمعدل 300 × جم لمدة 5 دقائق α.
5. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق وقم بتعليق الحبيبات في 10 مل من α-MEM.
6. إجراء تعداد الخلايا.
7. بذرة 1 × 10⁶ خلايا / 10 مل في طبق استزراع 10 سم وأضف M-CSF 100 نانوغرام / مل. التركيز النهائي ل M-CSF هو 100 نانوغرام / مل من وسط الاستزراع. احتضان المزرعة عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 3 أيام.

< p class = "jove_title" >2. توليد ناقضات العظام من BMM كسلائف ناقضات العظم

1. بعد 3 أيام ، قم بحصاد الخلايا المرفقة التي تمثل BMM كسلائف ناقضات العظم ، باتباع الخطوات 1.2-1.7.
2. بذور BMM في 5 × 10⁴ خلايا / 200 ميكرولتر من α-MEM في صفيحة 96 بئر. أضف RANKL للتركيز النهائي 50 نانوغرام / مل أو TNF-α للتركيز النهائي 100 نانوغرام / مل. أضف M-CSF للحصول على تركيز نهائي قدره 100 نانوغرام / مل لكل بئر.
3. أضف الجسم المضاد ل c-fms (التركيزات النهائية 0 ، 1 ، 10 ، 100 ، 1000 نانوغرام / مل) لكل بئر.
4. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 4 أيام. قم بتغيير الوسائط كل يومين لمدة 4 أيام.

< p class = "jove_title" >3. صبغة حمض الفوسفاتيز المقاوم للطرطرات (TRAP)

1. بعد 4 أيام من الحضانة ، قم بشفط وسط الثقافة لكل بئر برفق. اغسل كل بئر مرة واحدة ب 200 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة 1x PBS.
2. أضف 200 ميكرولتر من الفورمالين بنسبة 10٪ إلى كل بئر للتثبيت واحتضانه لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. استنشق الفورمالين واغسل كل بئر 3 مرات بالماء منزوع الأيونات.
3. أضف 200 ميكرولتر من 0.2٪ Triton X-100 في PBS إلى كل بئر للنفاذية واحتضانها لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. استنشق Triton X-100 واغسل كل بئر 3 مرات بالماء منزوع الأيونات.
4. أضف 200 ميكرولتر من محلول بقع TRAP إلى كل بئر. تصور البقعة تحت المجهر. سوف يستغرق الأمر من 10 إلى 30 دقيقة حتى تتطور البقعة بشكل صحيح.
5. استنشق البقعة واغسل كل بئر بالماء منزوع الأيونات 3 مرات ، وجففه في الهواء. احتفظ بها في درجة حرارة الغرفة لاستخدامها في مزيد من المراقبة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الجسم المضاد ل c-FMS AFS98 ، جسم مضاد أحادي النسيلة للفئران ، مضاد للمورين ، c-FMS (IgG2a) رانكل PEPROTECH 315-11 المؤتلف الفئر sRANK Ligand ، المصدر: بكتريا قولونية M-CSF M-CSF البشري المؤتلف. 1/10 حجم من CMG14-12 ثقافة خط الخلية طافي في خلايا 5X106 في طبق ثقافة معلق 10 سم. α-MEM واكو مع L-Glutamine والفينول الأحمر مصل الأبقار الجنينية الغرب الحيوي س 1820-500 مصل الأبقار الجنين أصل فرنسي طبق ثقافة كورنينج طبق نمط 100 مم × 20 مم لوحة 96 بئر ثيرموفيشر العلمي سطح دلتا كلون