حقن النانو الفيروسي داخل الصدر لدراسة تفاعلات الفيروس المضيف في الذباب البالغ

الملخص

المصدر: Yang, S., et al. إنشاء العدوى الفيروسية وتحليل تفاعل الفيروس المضيف في ذبابة الفاكهة السوداء. J. Vis. Exp. (2019).

في هذا الفيديو ، نصف إجراء لإجراء حقن نانوي لفيروس الحمض النووي الريبي أحادي الشريطة ذبابة الفاكهة الذكور البالغين ، ثم ندرس الاستجابات المضادة للفيروسات التي بدأت بسبب العدوى. يحدد تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل التنظيم الإضافي لجينات معينة في الذباب المصاب الذي يشير إلى تنشيط مسارات الاستجابة المناعية بما في ذلك تداخل الحمض النووي الريبي وإشارات JAK / STAT.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. عدوى فيروسية في ذبابة الفاكهة

1. يصيب الذباب عن طريق حقن النانو وإجراء فحوصات البقاء على قيد الحياة.
   1. اسحب الشعيرات الدموية لتحضير إبر الحقن ، واملأ إبرة الحقن بالزيت مرة أخرى ، وقم بتجميع الحاقن.
   2. ذباب التخدير على الوسادة تحت تدفق خفيف من ثاني أكسيد الكربون₂. تلقيح الذباب عن طريق الحقن داخل الصدر 50.6 نانولتر من محلول الفيروس (100 PFU ، مخفف بمحلول Tris-HCl ، درجة الحموضة 7.2). حقن ما لا يقل عن 3 قوارير من الذباب (20 ذبابة لكل قارورة).
      ملاحظه: يستغرق الحقن وقتا طويلا (بشكل عام 100 ذبابة في الساعة) وتكرار فيروس ذبابة الفاكهة C (DCV) سريع جدا ، لذلك من المهم جدا تدوين الوقت الدقيق على الأنبوب بمجرد الانتهاء من كل قارورة (20 ذبابة). يتم تعيين الحقن المؤقت فقط كعنصر تحكم وهمية. عادة ، يفضل ذكر الذباب البالغ ، حيث تكون النتائج أكثر استقرارا وقابلية للتكرار مقارنة باستخدام الإناث لأن الاختلافات الهرمونية أثناء التزاوج والتكاثر قد تؤثر على قراءة الإناث.
   3. تنمو الذباب المحقون عند 25 درجة مئوية ، 60٪ رطوبة تحت دورة الضوء / الظلام العادية. قم بتزويد الذباب بالطعام الطازج يوميا ، وسجل عدد الذباب الميت.
   4. قم بإجراء ما لا يقل عن 3 تكرارات بيولوجية ورسم منحنى البقاء على قيد الحياة.
   5. للتحليل الإحصائي لبيانات البقاء على قيد الحياة ، قم بإنشاء منحنيات بقاء كابلان ماير بواسطة برنامج إحصائي. قم بإجراء اختبار رتبة السجل لحساب قيم P. في جدول البقاء على قيد الحياة ، أدخل معلومات لكل موضوع. ثم يحسب البرنامج النسبة المئوية للبقاء على قيد الحياة في كل مرة ويرسم مؤامرة بقاء كابلان ماير.
      ملاحظه: لا تضيف خميرة إضافية إلى القارورة. بالمقارنة مع الضوابط الوهمية ، فإن الذباب المصاب ب DCV يعاني أحيانا من الاستسقاء وهو أخرق ، مما يجعله عرضة للخميرة اللزجة. من الأفضل تسجيل المزيد من النقاط الزمنية في التجربة الأولية لمعرفة الإطار الزمني الذي سيحدث فيه الموت الهائل للذباب المصاب. بشكل عام ، نادرا ما يموت الذباب المصاب خلال اليومين الأولين ، حتى بالنسبة لخطوط Dicer-2 المتحولة. بالنسبة للذبابة w1118 الخالية من Wolbachia (بلومنجتون 5905) المصابة ب 100 PFU من DCV ، فإن هذه النافذة الزمنية حوالي 3-5 أيام بعد الإصابة. لا ينبغي اعتبار ذباب الفاكهة الذي يموت في غضون 0.5 ساعة بعد الحقن وفيتا لأنه قد يقتل بسبب إصابة الإبرة وليس بسبب العدوى الفيروسية.

فئة

2. قياس حمل DCV عن طريق مقايسة التأثير الخلوي (CPE)

1. في اليوم 1 ، قم بإصابة ذكور الذباب كما هو موضح في الخطوات 1.1.1-1.1.2. قم بتجميع الذباب المحقون في مجموعات من 20 وحافظ على نموه على طعام الذباب الطازج للوقت المطلوب (عادة لمدة 24 ساعة أو 3 أيام). زود الذباب بالطعام الطازج يوميا.
2. في اليوم 2 ، بذور ذبابة الفاكهة S2 * الخلايا في طبق زراعة خلية 10 سم بكثافة حوالي 5 × 10⁶ إلى 1 × 10⁷ خلايا / مل.
3. في اليوم 3 ، اجمع 5 ذباب (تحت تدفق خفيف من ثاني أكسيد الكربون₂) وطحنها في أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل لمدة 30 ثانية مع 200 ميكرولتر من عازلة تريس وخرز السيراميك باستخدام الخالط. قم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية أو انتقل على الفور إلى الخطوة التالية.
4. دوامة العينة بدقة. استخدم حقنة سعة 1 مل وفلتر 0.22 ميكرومتر لتصفية المادة الطافية إلى أنبوب جديد سعة 1.5 مل.
5. قم بإجراء تخفيفات تسلسلية بمقدار 10 أضعاف للطافي مع وسيط كامل لخلايا S2 *. أضف 50 ميكرولتر من التخفيفات في البئر. أضف 50 ميكرولتر من وسط الاستزراع بدون فيروس إلى البئر المصنف على أنه بئر تحكم سلبي.
   ملاحظه: لكل معدل تخفيف ، تم استخدام 8 آبار. نظرا لأن عائد DCV النموذجي يبلغ حوالي 10^{8-10 9} PFU / مل ، يجب أن يغطي التخفيف على الأقل ~ 10-5-10-10.
6. في اليوم 4 ، راقب CPE باستخدام مجهر المجال الساطع بهدف 20X أو 40X. صنف البئر الذي تبدو فيه الخلايا ضبابية ، ويكون الوسط مليئا بالشظايا على أنه "بئر إيجابي" ، وبئر يكون فيه مورفولوجيا الخلية طبيعيا على أنه "بئر سلبي".
7. ضع علامة على الآبار الإيجابية أو السالبة CPE ب + أو - ، على التوالي. احسب متوسط الجرعة المعدية لزراعة أنسجة الفيروس (TCID₅₀).

فئة

3. تم قياس حمل DCV بواسطة qRT-PCR

1. في اليوم الأول ، يصيب الذباب كما هو موضح أعلاه. مجموعة من الذباب الذكور المحقون (20 ذبابة / مجموعة) وزراعتها على طعام الذباب الطازج للوقت المطلوب ، عادة لمدة 24 ساعة أو 3 أيام. زود الذباب بالطعام الطازج يوميا.
2. في اليوم 3 ، اجمع 5 ذباب تحت تدفق خفيف من ثاني أكسيد الكربون₂ في أنبوب 1.5 مل مع 200 ميكرولتر من محلول التحلل و 20 حبة خزفية (القطر = 0.5 مم) ، وطحن العينات بواسطة الخالط بسرعة عالية لمدة 30 ثانية. أضف 800 ميكرولتر من مخزن التحلل الإضافي إلى كل أنبوب وقم بتخزين العينات عند -80 درجة مئوية أو قم بإجراء استخراج الحمض النووي الريبي على الفور و qRT-PCR.
3. قم بإعداد أطراف وأنابيب خالية من RNase ومياه منزوع الأيونات ومعالجة ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) والمياه المفلترة بالغشاء 0.22 ميكرومتر. أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم (≥99.5٪) إلى العينة ورجه بقوة لمدة 15 ثانية باليد. احتضن لمدة 5 دقائق أو أكثر في درجة حرارة الغرفة حتى يتم فصل مرحلة الماء عن المرحلة العضوية بوضوح.
   ملاحظه: الكلوروفورم خطير للغاية ويجب التعامل معه بحذر. لا تقم بتدوير العينة ، مما يزيد من خطر تلوث الحمض النووي.
4. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 13,000 × جم لمدة 15 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
5. اجمع 400 ميكرولتر من المادة الطافية وانقل المادة الطافية إلى أنابيب جديدة. تخلط بنفس الحجم من الأيزوبروبانول (≥ 99.5٪) ، اقلب العينات برفق 20 مرة باليد ، ثم ترسبها لمدة 10 دقائق أو أكثر في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: سيؤدي هطول الأمطار عند -20 درجة مئوية إلى زيادة غلة الحمض النووي الريبي.
6. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 13,000 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تظهر كريات الحمض النووي الريبي الأبيض في الجزء السفلي من الأنبوب.
7. تخلص من المادة الطافية وأضف 1 مل من 70٪ من الإيثانول (الإيثانول في ماء DEPC) واقلبها عدة مرات لغسل الحمض النووي الريبي.
8. عينات أجهزة الطرد المركزي عند 13,000 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. يجب أن يصبح الحمض النووي الريبي شفافا.
9. أضف 50 ميكرولتر من ماء DEPC إلى العينة ، والماصة لعدة مرات ، والدوامة.
10. خذ 3 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي لمعايرة تركيز الحمض النووي الريبي. حدد كمية الحمض النووي الريبي عند 260 نانومتر. عادة ما يكون تركيز الحمض النووي الريبي المستخرج بواسطة هذا البروتوكول حوالي 100-500 ميكروغرام / ميكرولتر ، وهو مناسب لتخليق (كدنا).
11. استخدم 2 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي لتخليق (كدنا). خفف العينة إلى 100 ميكرولتر مع ddH₂O وخزنها في -20 درجة مئوية.
12. قم بإجراء qRT-PCR وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بتشغيل qRT-PCR.
    ملاحظه: بالنسبة لتخليق (كدنا) ل DCV ، عملت البادئات العشوائية بشكل أفضل بكثير من بادئات Poly A. يتم تطبيع تعبير DCV mRNA إلى البروتين الريبوزومي الداخلي 49 (rp49) mRNA. بادئات قليل النوكليوتيد المستخدمة في هذا الجزء:
    RP49 5 'AGATCGTGAAGAAGCGCACCAAG 3' (إلى الأمام) و
    5 'CACCAGGAACTTCTTGAATCCGG 3' (عكس) ؛
    DCV ، 5 'TCATCGGTATGCACATTGCT 3' (إلى الأمام) و
    5 'CGCATAACCATGCTCTTG 3' (عكسي) ؛ < / > vago ، 5 'TGCAACTCTGGGAGGATAGC 3' (إلى الأمام) و
    5 'AATTGCCCTGCGTCAGTTT 3' (عكسي) ؛ < / > الحمض النووي الريبي الناجم عن الفيروس 1 (vir-1) 5 'GATCCCAATTTTCCCATCAA 3' (إلى الأمام) و
    5 'GATTACAGCTGGGTGCACAA 3' (عكس).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مجهر أوليمبوس CKX41 حاقن Nanoject II Auto-Nanoliter دروموند العلمي 3-000-204 حاقن أوتوماتيكي Nanoject II متغير الحجم (2.3 إلى 69 نانولتر) مع شعيرات دموية زجاجية (110 فولت) وسط حشرة شنايدر سيغما S9895 زراعة الخلايا طبق زراعة الخلايا 10 سم سيغما CLS430167 زراعة الخلايا ذبابة الفاكهة حاضنة بيرسيفال ط 41NL تربية ذبابة الفاكهة مرشح 0.22um ميليبور SLGP033RS 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة وسم 352070 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الخالية من RNase أكسايجن MCT-150-C نظام ABI 7500 qPCR ابي 7500 د.م qPCR الطرد المركزي إيبندورف 5810 ص الطرد المركزي إيبندورف 5424 ص كلوروفورم سيغما 151858 استخراج الحمض النووي الريبي مياه DEPC سيغما 95284-100 مل استخراج الحمض النووي الريبي كحول الأيزوبروبيل سيغما I9516 استخراج الحمض النووي الريبي المخزن المؤقت للتحلل (استخراج الحمض النووي الريبي) ثيرمو فيشر 15596026 كاشف TRIzol المخزن المؤقت للتحلل (استخراج الحمض النووي الريبي للعينة السائلة) ثيرمو فيشر 10296028 كاشف TRIzol LS فيلم لاصق بصري ابي 4360954 qPCR البنسلين الستربتومايسين ، سائل إنفيتروجين 15140-122 زراعة الخلايا لوحة qPCR ابي أ32811 qPCR البرمجيات الإحصائية GraphPad المنشور 7 TransScript يطير أول حبلا (كدنا) التوليف SuperMix TransScript AT301 استخراج الحمض النووي الريبي دوار إيكا الدوامة 3 استخراج الحمض النووي الريبي FBS إنفيتروجين هاتف: 12657-029 زراعة الخلايا قاع مسطح 96 لوحة بئر سيغما CLS3922 زراعة الخلايا حاضنة الخلية سانيو مير-553 100 أنبوب بديل دروموند العلمي 3-000-203-جم / إكس