تلطيخ الهيماتوكسيلين والأيوسين لتقييم تلف القولون في التهاب القولون الناجم عن DSS

الملخص

المصدر: Du ، Y. ، et al. تأثيرات إلغاء بروتين إشارات التذوق على التهاب الأمعاء في نموذج الفأر الالتهابي لمرض الأمعاء. J. Vis. Exp. (2018)

يوضح هذا الفيديو طريقة تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (H&E) لتقييم تلف القولون في نموذج الفئران لالتهاب القولون الناجم عن DSS - وهو مرض التهاب الأمعاء. عند عزل القولون عن الفأر المعالج ب DSS والحصول على أجزاء من الأنسجة ، يساعد تلطيخ H & E للأقسام في تحديد تلف الأنسجة بوساطة الالتهاب.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير الفئران و DSS

1. احتفظ بالضربة القاضية (α-gustducin ^-/-) الفئران والتحكم من النوع البري المطابق للعمر والجنس ووزن الجسم (α-gustducin ^+/+) C57BL / 6 بشكل فردي في أقفاص نظيفة.
   ملاحظه: تم تهجين الفئران بالضربة القاضية مع الفئران C57BL / 6 لأكثر من 20 جيلا ولديها خلفية وراثية C57BL / 6 بنسبة 100٪ تقريبا.
2. قم بإذابة 30 جم من مسحوق كبريتات ديكستران الصوديوم (DSS) في 1 لتر من الماء المعقم. امزج حتى يصبح المحلول واضحا للتأكد من أن تركيز العمل النهائي هو 3٪ (وزن / حجم).
   ملاحظه: يمكن تخزين محلول DSS في درجة حرارة الغرفة لمدة تصل إلى أسبوع واحد أو عند 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.

< p class = "jove_title" >2. تحريض وتقييم التهاب القولون DSS في الفئران

1. قم بوزن وتسجيل وزن الجسم الأولي لكل فأر. ضع الفئران بشكل فردي في أقفاص بلاستيكية قياسية وقم بتسمية الأقفاص.
2. استبدل مياه الشرب العادية بمحلول DSS بنسبة 3٪ لمدة 7 أيام يمكن لكلتا المجموعتين من الفئران الوصول إليها بشكل خاص.
3. قم بقياس وزن جسم الماوس ، وتسجيل استهلاك محلول DSS ، وجمع وفحص براز كل فأر يوميا أثناء إدارة DSS. لاحظ شدة الإسهال ونزيف المستقيم وقم بتحويله إلى مؤشر المرض الناجم عن DSS.
4. أثناء التجربة ، يتم حساب النسبة المئوية لفقدان الوزن مقارنة بالوزن الأولي ومؤشر المرض لتقييم أعراض التهاب القولون.
   ملاحظه: يتم تسجيل مؤشر المرض من خلال الجمع بين ملاحظات الإسهال ونزيف المستقيم ويتم تعريفه على النحو التالي: 0 (براز طبيعي ، بدون دم) ، 1 (براز ناعم ، بدون دم) ، 2 (براز ناعم ، قليل من الدم) ، 3 (براز ناعم جدا ، نزيف متواضع) ، و 4 (براز مائي ، نزيف حاد). يتم تحليل مؤشر المرض يوميا لكل فأر.
5. بحلول نهاية علاج DSS لمدة 7 أيام ، ضحي بالفئران عن طريق خلع عنق الرحم واستمر في التجارب المتبقية.

< p class = "jove_title" >3. تحضير عينات الأنسجة

1. ضع الفأر في وضع ضعيف ونظف جلد البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. قم بعمل شق خط الوسط بطول 3 سم في البطن بمقص صغير لكشف تجويف البطن.
2. استخدم زوجا من الملقط لفصل الطحال بعناية عن الأنسجة الأخرى ، ثم قم بإزالة الطحال وقياس حجمه.
3. تحديد القولون وارفعه بالملقط وفصله عن المساريق المحيط. اسحب القولون بالكامل حتى يظهر الأعور والمستقيم.
4. اعزل القولون عن طريق تحويله إلى هامش القولون وعمق الحوض لتحرير القولون القريب والبعيد ، على التوالي. ثم قم بقياس وتسجيل طول القولون المعزول. احرص على عدم إتلاف أنسجة القولون أثناء إجراء التشريح.
5. اغسل القولون ب 10 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات المثلج (PBS) باستخدام حقنة سعة 10 مل مزودة بإبرة تزقيم لإزالة البراز والدم حتى يصبح الشطف صافيا تماما.
6. لتحديد النسيجية ، قسم عينات الأنسجة بالتساوي إلى ثلاثة أجزاء: القريبة والوسطى والبعيدة. بعد ذلك ، قم بإصلاح الأنسجة بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) طوال الليل عند 4 درجات مئوية.

4. التقييم النسيجي لشدة التهاب القولون الناجم عن DSS

1. تلطيخ الهيماتوكسيلين واليوزين (H&E)
   1. بعد التثبيت ، اغمر الأنسجة في محلول من 30٪ سكروز في 1x PBS طوال الليل في أنبوب سعة 15 مل لحماية العينات بالتبريد.
   2. قم بتضمين الأنسجة في مركب درجة حرارة القطع المثلى (OCT) وضعها عند -20 درجة مئوية حتى تصلب OCT.
   3. انقل كتلة OCT التي تحتوي على الأنسجة إلى ناظم التبريد ، واضبط قرص السماكة في ناظم البرد على 12 ميكرومتر ، وقم بتقطيع وجمع الأقسام المجمدة بسمك 12 ميكرومتر.
   4. قم بتسخين أقسام الأنسجة المجمعة من ناظم البرد عند 65 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة على لوح ساخن.
   5. اغسل الأقسام لفترة وجيزة بالماء المقطر. قم بتلطيخها بمحلول تلطيخ الهيماتوكسيلين لمدة 5 دقائق ثم اشطفها بماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق.
   6. ميز الأقسام بحمض الهيدروكلوريك والإيثانول بنسبة 0.5٪ لمدة 30 ثانية واشطفها بماء الصنبور الجاري لمدة 1 دقيقة. بعد ذلك ، قم بإجراء الغسيل في 1x PBS لمدة 1 دقيقة ثم اشطفه بماء الصنبور الجاري لمدة 5 دقائق.
   7. قم بغسل أقسام الأنسجة في 70٪ و 75٪ و 80٪ و 95٪ كحول ، كل منها لمدة 10 ثوان.
   8. قم بإجراء الجفاف من خلال 95٪ كحول و 2 تغيير من الكحول المطلق لمدة 5 دقائق في كل مرة. امسح في 2 تغييرات من الزيلين لمدة 5 دقائق.
   9. سجل تلف الأنسجة في القولون القريب والمتوسط والبعيد لكل فأر لكل من الضربة القاضية الجينية والمجموعات البرية بناء على نتائج تلطيخ H&E أعلاه.
      ملاحظه: مؤشر المرض هو درجة مجمعة للتلف الظهاري والالتهاب في مناطق الغشاء المخاطي وتحت الغشاء المخاطي والعضلات والمصل ، والتي يتم تعريفها على النحو التالي: 0 (لا يوجد تلف والتهاب في الأنسجة) ، 1 (تلف الأنسجة البؤرية والتهابها) ، 2 (تلف الأنسجة غير المكتملة والتهابها) ، و 3 (تلف الأنسجة المنتشرة والالتهاب). ثم يتم جمع ثلاث درجات لكل فأر للأجزاء القريبة والوسطى والبعيدة من القولون للحصول على درجة إجمالية لكل. ثم يتم حساب متوسط الدرجات لكل مجموعة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ديكستران كبريتات ملح الصوديوم (DSS) MP الطب الحيوي 2160110 طقم تلطيخ H&E بي بي آي لعلوم الحياة E607318 محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) سانغون للتكنولوجيا الحيوية B548117 د.ب 10 مل حقنة BD Biosciences 309604 الأدوات والمعدات توازن مقص ملقط تلطيخ الجرار برمجيات Imag-Pro Plus ميديا سايبرنتيكس ، إنك.