تصور تنشيط الكاسباز في البلاعم المشتقة من الخلايا الأحادية البشرية

Abstract

< p class = "jove_content" >المصدر: Bolívar ، B. E. ، et al. ، تصور الكاسبيسات الالتهابية الناجمة عن القرب في البلاعم المشتقة من الخلايا الوحيدة البشرية. J. Vis. Exp. (2022).

يوضح هذا الفيديو تنشيط بروتينات الكاسباز في البلاعم البشرية باستخدام بروتينات مراسل تكميل التألق ثنائي الجزيئ. يتم دمج المجالات المؤيدة ل caspase-1 مع شظايا غير فلورية من بروتينات كوكب الزهرة ، والتي يتم تجنيدها في مجمعات الالتهاب. يؤدي قرب الالتهابات إلى إعادة طي شظايا كوكب الزهرة وتألقاها ، مما يؤكد تنشيط الكاسباز في الضامة.

Protocol

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. عزل الخلايا الوحيدة البشرية والتمايز إلى البلاعم

1. الحصول على دم مضاد للتخثر من الأفراد الأصحاء غير المعروفين في بنك الدم الإقليمي وعزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs) كما هو موضح أدناه.
   ملاحظه: قم بتنفيذ جميع الخطوات في غطاء التدفق الصفحي لزراعة الأنسجة. استخدم أنابيب معقمة فقط وارتد القفازات. أضف 10٪ مبيض إلى جميع المنتجات المتعلقة بالدم عند التخلص منها. يمكن استخدام المحلول الملحي المعقم الممخزن بالفوسفات (PBS) (1x) أو محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (بدون Ca²⁺ و Mg²⁺) بالتبادل.
   1. تحضير المخزن المؤقت للتخفيف: استكمل 1x PBS معقم مع مصل بقري جنيني 2٪ (FBS) و 0.5 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA).
   2. تحضير وسط الاستزراع: مكمل وسط RPMI-1640 مع FBS (10٪ (حجم / حجم)) ، غلوتاماكس (2 ملي مولار) ، والبنسلين / الستربتومايسين (50 وحدة دولية / 50 ميكروغرام / مل)
   3. قم بتبريد المخزن المؤقت قيد التشغيل (جدول المواد) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
   4. تمييع الدم الكامل بمجلدين من المخزن المؤقت للتخفيف. باستخدام ماصة مصلية ، انقل 15 مل من الدم المضاد للتخثر إلى أنبوب سعة 50 مل يحتوي على 30 مل من مخزن التخفيف. تخلط بلطف عن طريق الانعكاس.
   5. لكل 10 مل من الدم الكامل أو 30 مل من الدم المخفف ، أضف 15 مل من وسط تدرج الكثافة إلى أنبوب فارغ سعة 50 مل.
   6. ضع طبقة من وسط تدرج الكثافة من الخطوة 1.1.5 مع 30 مل من الدم المخفف ببطء وثبات باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل. احتفظ بطرف الماصة على جدار الأنبوب والأنبوب بزاوية مائلة.
   7. انقل الأنابيب بعناية إلى جهاز طرد مركزي دلو متأرجح. تجنب إزعاج المرحلتين. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 400 × جم في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 25 دقيقة مع ضبط التسارع والتباطؤ على الحد الأدنى للقيمة.
   8. قم بإزالة طبقة البلازما العلوية (الشفافة) بعناية باستخدام ماصة سعة 10 مل وتخلص منها في وعاء به مبيض (10٪).
   9. اجمع الطبقة البينية (البيضاء) من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs ، الشكل 1) باستخدام ماصة 10 مل وانقلها إلى أنبوب جديد سعة 50 مل. اجمع الطبقة البيضاء من أنابيب مختلفة من نفس المتبرع في أنبوب 50 مل حتى 30 مل.
   10. اجعل كل أنبوب بحجم إجمالي قدره 50 مل مع مخزن التخفيف المؤقت من الخطوة 1.1.1 وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل وتخلص منها في وعاء به مبيض (10٪).
   11. أعد تعليق كل حبيبات خلية في 1 مل من المخزن المؤقت للتشغيل المبرد مسبقا من الخطوة 1.1.3 باستخدام ماصة دقيقة p1000. اجمع معلقات الخلايا من نفس المتبرع في أنبوب جديد سعة 15 مل. ارفع حجم كل أنبوب إلى 15 مل مع عازلة تشغيل مبردة مسبقا واخلطها جيدا عن طريق الانعكاس.
   12. خذ 20 ميكرولتر من تعليق الخلية من الخطوة 1.1.11 وقم بإعداد تخفيف 1: 100 باستخدام 1x PBS معقم. حدد رقم الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم.
   قم
   13. بالطرد المركزي لتعليق الخلية من الخطوة 1.1.11 عند 300 × جم و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق وقم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل. إذا لزم الأمر، استخدم ماصة دقيقة p200 لإزالة المادة الطافية تماما.
   14. أعد تعليق PBMCs المعزولة في 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت الذي يعمل بوحدات MAC المبردة مسبقا لكل خلية 1 × 10⁷ ، مع إضافة ما يصل إلى 800 ميكرولتر كحد أقصى من المخزن المؤقت.
   15. أضف 20 ميكرولتر من حبيبات CD14 الدقيقة المضادة للإنسان لكل 1 × 10⁷ خلايا أو ما يصل إلى 100 ميكرولتر لكل عينة دم (~ 100 مل من الدم غير المخفف). تخلط جيدا عن طريق الانعكاس وتوضع على أنبوب دوار لمدة 20 دقيقة مع الخلط المستمر عند 4 درجات مئوية.
   16. قم بإزالة العينات من محور دوار الأنبوب ، وأضف 10 مل من المخزن المؤقت المبرد مسبقا إلى كل أنبوب ، وجهاز الطرد المركزي عند 300 × جم (التسارع = 5 ، التباطؤ = 5) و 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
   17. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل وأعد تعليق ما يصل إلى 1 × 10⁸ خلايا في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت المبرد مسبقا (2 × 10⁸/مل).
   18. قم بعزل الخلايا الإيجابية CD14 عن طريق فرز الخلايا المغناطيسية باستخدام نظام يدوي أو آلي (جدول المواد) وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   19. خذ 20 ميكرولتر من تعليق الخلية من الخطوة 1.1.18 بعد الاختيار الإيجابي CD14 وقم بإعداد تخفيف 1: 100 باستخدام 1x PBS معقم. حدد رقم الخلية عن طريق حساب الخلايا على مقياس كثافة الدم.
   20. قم بالطرد المركزي للخلايا الإيجابية CD14 عند 300 × جم و RT لمدة 10 دقائق. قم بإزالة المادة الطافية باستخدام ماصة سعة 10 مل أو نظام تفريغ.
   21. أعد تعليق حبيبات الخلية من الخطوة 1.1.20 في وسط مزرعة مسخن مسبقا من الخطوة 1.1.2 إلى كثافة الخلية النهائية 1 × 10⁷ خلايا / مل.
2. قم بزرع الخلايا الوحيدة المعزولة الإيجابية CD14 بكثافة خلية 5 × 10⁶ خلايا.
   1. في طبق زراعة الأنسجة مقاس 10 سم ، أضف 10 مل من وسط المزرعة من الخطوة 1.1.2 مكملا بعامل تحفيز مستعمرة الخلايا الحبيبية والبلاعم 50 نانوغرام / مل (GM-CSF).
   2. أضف 0.5 مل من تعليق الخلية من الخطوة 1.1.21 إلى وسط المزرعة بالتنقيط وقم بتدوير اللوحة برفق. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) بين عشية وضحاها.
   3. في اليوم التالي ، قم بشفط الوسط باستخدام نظام تفريغ لإزالة الخلايا التي لم تلتصق بين عشية وضحاها. أضف 10 مل من وسط الاستزراع الطازج المكمل GM-CSF (50 نانوغرام / مل) واحتضان الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة 7 أيام للسماح بالتمايز الكامل (انظر الشكل 2 أ لظهور الخلايا الوحيدة CD14 + في مراحل مختلفة من التمايز في GM-CSF). تبادل وسط الاستزراع كل 2-3 أيام واستكمل مع GM-CSF الطازج (50 نانوغرام/مل) في كل مرة.

< p class = "jove_title" >2. تحضير مكونات التثقيب الكهربائي

ملاحظة: تم تصميم هذا البروتوكول لطرف 10 ميكرولتر نيون (جدول المواد). لكل تعداء ، استخدم 1-2 × 10⁵ خلايا. يوصى بزرع الخلايا المنقولة على طبق مكون من 48 بئرا أو طبق مكون من 8 آبار (10 ميكرولتر من الخلايا المنقولة لكل بئر). يمكن استخدام 1x DPBS معقم (بدون Ca²⁺ و Mg²⁺) بدلا من PBS.

1. في اليوم 7، قم بإعداد وسط خال من المضادات الحيوية عن طريق استكمال وسط RPMI-1640 ب FBS (10٪ (حجم / حجم)) وغلوتاماكس (2 ملليمتر).
2. ضع محلول RPMI-1640 المتوسط الخالي من المصل ، محلول التربسين-EDTA (0.25٪) ، 1x PBS معقم (بدون Ca²⁺ و Mg²⁺) ، ووسط مزرعة كامل من الخطوة 1.1.2 في حمام مائي 37 درجة مئوية.
3. في حالة استخدام أطباق ذات قاع زجاجي (للفحص المجهري متحد البؤر) ، قم بتغطية الأطباق بهيدروبروميد بولي دي ليسين.
   1. قم بتغطية طبق من 8 غرف جيدة ب 200 ميكرولتر من هيدروبروميد بولي دي ليسين (0.1 مجم / مل في 1x PBS معقم) واحتضنه لمدة 5 دقائق في RT.
   2. قم بشفط محلول poly-D-lysine واغسل الزجاج مرة واحدة باستخدام 1x PBS معقم. استنشق PBS وتابع الخطوة 2.4.
4. أضف 200 ميكرولتر من الوسط الخالي من المضادات الحيوية لكل بئر من الصفيحة المكونة من 48 بئرا أو 8 أطباق جيدة الغرف واحتضانها مسبقا في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) حتى تصبح جاهزة لصفيحة الخلايا المنقولة.

< p class = "jove_title" >3. تحضير الخلايا للتثقيب الكهربائي

ملاحظة: يبلغ عائد MDM من طبق 10 سم في نهاية فترة التمايز التي تبلغ 7 أيام حوالي 1.5 × 10⁶ خلايا. يمكن استخدام 1x DPBS معقم (بدون Ca²⁺ و Mg²⁺) بدلا من PBS. تم تحسين هذا البروتوكول بحيث يتم فصل معظم البلاعم عن اللوحة مع الحفاظ على صلاحية الخلية وسلامتها. يصعب فصل MDM عن ألواح زراعة الخلايا. لذلك ، قد يكون من الضروري تنفيذ الخطوتين 3.2 و 3.3 مرتين لفصل الخلايا. تأكد من أن كل وقت حضانة مع التربسين EDTA (0.25٪) لا يتجاوز 5 دقائق.

1. استنشق الوسائط من البلاعم المتمايزة تماما على أطباق مقاس 10 سم واغسل الخلية أحادية الطبقة باستخدام وسيط RPMI-1640 دافئ خال من المصل. تأكد من إزالة الوسيط تماما.
2. احصد الخلايا عن طريق إضافة 2 مل من محلول التربسين الدافئ EDTA (0.25٪) لكل طبق 10 سم واحتضانه في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) لمدة 5 دقائق.
3. أكمل انفصال الخلية عن طريق سحب محلول التربسين-EDTA (0.25٪) برفق لأعلى ولأسفل على منطقة الطبق بأكملها باستخدام ماصة دقيقة p1000. انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل يحتوي على 5 مل من وسط الثقافة الكامل الدافئ من الخطوة 1.1.2.
4. خذ الطبق إلى مجهر المجال الساطع وتحقق من انفصال الخلايا في مجالات الرؤية المختلفة. إذا كان هناك عدد كبير من الخلايا لا تزال متصلة ، كرر الخطوات 3.2-3.3.
5. جهاز الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 250 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
6. استنشق الوسط وأعد تعليق الخلايا في 10 مل من 1x PBS معقم تم تسخينه مسبقا إلى 37 درجة مئوية. خذ 20 ميكرولتر لتحديد رقم الخلية باستخدام مقياس كثافة الدم.
7. خذ 1-2 × 10⁵ خلايا لكل تعداء مقصود وضعها في أنبوب سعة 15 مل. يصل إلى الحجم النهائي البالغ 15 مل مع PBS المعقم 1x الدافئ مسبقا. جهاز طرد مركزي عند 250 × جم لمدة 5 دقائق في RT.
8. قم بشفط PBS وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى لمدة 1 دقيقة عند 250 × جم. قم بإزالة أي بقايا PBS من حبيبات الخلية باستخدام ماصة دقيقة p200.

< p class = "jove_title" >4. نواة مكونات الكاسباز BiFC في البلاعم البشرية المشتقة من الخلايا الوحيدة

ملاحظة: يتم تنفيذ هذا القسم من البروتوكول باستخدام نظام نيون للتعداء (جدول المواد). يحدد هذا البروتوكول خطوات نقل 1-2 × 10⁵ خلايا باستخدام طرف نيون 10 ميكرولتر (جدول المواد). إذا كنت تستخدم طرف نيون سعة 100 ميكرولتر ، فقم بالتوسع وفقا لذلك. تجنب تعريض الخلايا لإعادة تعليق المخزن المؤقت R لأكثر من 15 دقيقة ، لأن هذا قد يقلل من قابلية الخلية للحياة وكفاءة التعداد.

1. قم بتخفيف بلازميد المراسل (أي mCherry أو dsRedmito عند 100 نانوغرام / ميكرولتر) في ماء خال من النوكلياز أو 0.5x TE buffer لتصور الخلايا المنقولة.
2. قم بتخفيف بلازميدات الكاسباز BiFC إلى تركيز مناسب في الماء الخالي من النوكلياز أو المخزن المؤقت TE 0.5x ، بحيث لا يتجاوز الحجم الكلي للبلازميدات 30٪ من إجمالي حجم التعداء البالغ 10 ميكرولتر (أي 300 نانوغرام / ميكرولتر من C1 Pro-VC و 300 نانوغرام / ميكرولتر من C1 Pro-VN).
3. قم بإعداد أنبوب دقيق معقم سعة 1.5 مل لكل تعداء مقصود وأضف الكمية المناسبة من بلازميد المراسل (أي 50 نانوغرام أو 0.5 ميكرولتر) وبلازميدات كاسباز BiFC (أي 300 نانوغرام أو 1 ميكرولتر من C1 Pro-VC و 300 نانوغرام أو 1 ميكرولتر من جزء C1 Pro-VN). احتفظ بالأنابيب الدقيقة في غطاء المحرك في جميع الأوقات.
4. ضع محطة الماصة والجهاز والنصائح وأنابيب التثقيب الكهربائي والماصة في غطاء تدفق رقائقي معقم.
   ملاحظه: يتم تضمين محطة الماصة والجهاز والنصائح وأنابيب التثقيب الكهربائي والماصة في نظام نيون للتعديد.
5. قم بتوصيل موصل الجهد العالي والمستشعر الموجود في محطة الماصة بالمنافذ الخلفية على الجهاز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. احتفظ بمحطة الماصة بالقرب من الجهاز.
6. قم بتوصيل سلك الطاقة بمدخل التيار المتردد الخلفي وتابع توصيل الجهاز بمأخذ التيار الكهربائي. اضغط على مفتاح الطاقة لتشغيل الجهاز.
7. أدخل معلمات الإرسال في شاشة بدء التشغيل المعروضة عند تشغيل الجهاز وتوصيله بشكل مناسب. اضغط على الجهد ، وأدخل 1000 ، واضغط على Done لضبط الجهد على 1000 فولت ، اضغط على العرض ، وأدخل 40 ، واضغط على تم لضبط مدة النبضة على 40 مللي ثانية. أخيرا ، اضغط على # نبضات ، وأدخل 2 ، واضغط على تم لضبط عدد النبضات الكهربائية على 2.
8. خذ أحد أنابيب التثقيب الكهربائي (المتوفرة في المجموعة) واملأه ب 3 مل من المخزن المؤقت الإلكتروليتي E (لأطراف 10 ميكرولتر والمتوفر في المجموعة) في RT. أدخل أنبوب التثقيب الكهربائي في حامل الماصة في محطة الماصة. تأكد من أن القطب الكهربائي الموجود على جانب الأنبوب متجها للداخل وأن صوت النقر مسمع عند إدخال الأنبوب.
9. خذ حبيبات الخلية من الخطوة 3.8 وأضف 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت R لإعادة التسخين مسبقا (المتوفرة في المجموعة) لكل 1-2 × 10⁵ خلايا. تخلط برفق باستخدام ماصة دقيقة p20. أضف 10 ميكرولتر من معلق الخلية إلى كل أنبوب تم إعداده في الخطوة 4.3 واخلطه برفق باستخدام ماصة دقيقة p20.
10. خذ الماصة وأدخل طرفا بالضغط على زر الضغط في المحطة الثانية. تأكد من أن المشبك يلتقط جذع تثبيت المكبس في الطرف تماما وأنه لا توجد فجوة في الرأس العلوي للماصة.
11. لشفط العينة، اضغط على زر الضغط على الماصة حتى المحطة الأولى واغمسها في الأنبوب الأول الذي يحتوي على خليط الحمض النووي للخلية/البلازميد. شفط الخليط ببطء في طرف الماصة.
    ملاحظه: تجنب فقاعات الهواء لأنها يمكن أن تسبب الانحناء أثناء التثقيب الكهربائي ، وإذا اكتشفها الجهاز ، يمكن أن تمنع توصيل النبضة الكهربائية. إذا لوحظت فقاعات هواء ، فحرر المحتويات في الأنبوب وحاول الشفط مرة أخرى.
12. أدخل الماصة مع العينة بعناية فائقة في حامل الماصة. تأكد من أن الماصة تنقر وأنها موضوعة بشكل صحيح.
13. اضغط على ابدأ على شاشة اللمس وانتظر حتى يتم توصيل النبضات الكهربائية. ستشير رسالة على الشاشة إلى الانتهاء.
14. قم بإزالة الماصة ببطء من المحطة وأضف تعليق الخلية المنقولة على الفور إلى البئر المقابل مع وسط خال من المضادات الحيوية مسخن مسبقا من الخطوة 2.4 عن طريق الضغط ببطء على زر الضغط إلى المحطة الأولى.
    ملاحظه: يمكن إعادة استخدام هذا الطرف حتى ثلاث مرات لنفس البلازميد ؛ خلاف ذلك ، تخلص منه في حاوية نفايات بيولوجية عن طريق الضغط على زر الضغط إلى المحطة الثانية.
15. كرر الخطوات 4.10-4.14 لكل أنبوب يحتوي على خليط الحمض النووي الخلوي / البلازميد.
16. هز اللوحة برفق بالخلايا المنقولة واحتضانها لمدة 1-3 ساعات في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}).
17. أضف إلى كل بئر 200 ميكرولتر من وسط الاستزراع المسخن مسبقا (وسط كامل) من الخطوة 1.1.2. ضع الطبق في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) مرة أخرى. اترك 24 ساعة على الأقل للتعبير الجيني.
18. في اليوم التالي ، افحص صلاحية الخلية وكفاءة التعدي باستخدام مجهر اللفائف الفلوري.
    1. قم بتشغيل مجهر epifluorescence وصندوق مصدر ضوء الفلورسنت وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وضع طبق الثقافة على مرحلة المجهر.
    2. حدد الهدف 10x أو 20x وعامل التصفية 568 نانومتر (RFP).
    3. لتقدير صلاحية الخلية، اضغط على زر LED للضوء المرسل (TL) لتصور جميع الخلايا في الحقل المحدد. أثناء النظر إلى عدسة المجهر ، أدر مقبض التركيز البؤري حتى تتم ملاحظة الخلايا وتحقق من ارتباط الخلية في الحقل المحدد.
       ملاحظه: تمثل الخلايا المتصلة بالكامل الخلايا القابلة للحياة بينما تمثل الخلايا العائمة خلايا غير قابلة للحياة. إذا كان التقاء البئر مرتفعا ، فقد يكون وجود الخلايا غير المرتبطة نتيجة المبالغة في تقدير عدد الخلايا وليس نتيجة لانخفاض قابلية البقاء. ومع ذلك ، فإن التقاء منخفض مصحوبا بمحتوى عال من الخلايا العائمة يدل على انخفاض قابلية البقاء التي قد تنتج عن الانحناء أثناء التثقيب الكهربائي أو سمية البلازميد أو التعرض المفرط للمخزن المؤقت لإعادة التعليق R. لا تستخدم الآبار التي تعرض السلوك الأخير.
    4. لتقدير كفاءة التعدي ، ركز على الخلايا في المجال المحدد تحت الضوء المنقول كما هو موضح أعلاه. احسب العدد الإجمالي للخلايا في الحقل المحدد. مع إيقاف تشغيل مؤشر LED للضوء المرسل (TL)، اضغط على زر LED للضوء المنعكس (RL) للتشغيل.
    5. ركز جيدا على مضان الجين المراسل (الخلايا الحمراء) واحسب العدد الإجمالي للخلايا الفلورية الحمراء. كرر هذه الخطوات (4.18.4-4.18.5) لحقلين آخرين على الأقل لكل بئر.

< p class = "jove_title" >5. معالجة الحصول على بيانات MDM و caspase BiFC المنقولة

< p class = "jove_content" >ملاحظة: إذا كنت تخطط لتصوير الخلايا باستخدام مجهر متألق أو مجهر متحد البؤر ، ينصح بالعلاج ب qVD-OPh (20 ميكرومتر) لمدة ساعة واحدة قبل العلاج بالحافز المختار لمنع موت الخلايا المعتمدة على الكاسباز (موت الخلايا المبرمج في الغالب). يستخدم هذا في التصوير لمنع الخلايا من الانطلاق بسبب موت الخلايا المبرمج ، مما يجعل من الصعب جدا تصويرها أثناء خروجها من المستوى البؤري. لاحظ أن تجنيد الكاسباز في منصة التنشيط وكاسباز BiFC المرتبط به لا يعتمد على النشاط التحفيزي للكاسباز ، وبالتالي ، لن يؤثر تثبيط الكاسباز على هذه الخطوة.

1. عالج بالمنبه المختار بعد حوالي 24 ساعة من التعدي واحتضانه طالما كان ذلك ضروريا لكل دواء.
   1. قم بإعداد وسيط التصوير عن طريق استكمال وسط الاستزراع من الخطوة 1.1.2 ب Hepes (20 ملي مولار ، درجة الحموضة 7.2-7.5) و 2-mercaptoethanol (55 ميكرومتر).
   2. أضف التركيز المطلوب من المنبه إلى وسط التصوير المسخن مسبقا واخلطه برفق.
   3. قم بإزالة الوسائط من الخلايا بعناية باستخدام ماصة دقيقة p1000 وأضف 500 ميكرولتر من محلول التحفيز من الخطوة 5.1.2 أسفل جانب البئر.
   4. لتشغيل آبار التحكم غير المعالجة ، أضف وسيط تصوير بدون المنبه.
   5. احتضان الخلايا في حاضنة زراعة الأنسجة المرطبة (37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}) للمدة المحددة لكل علاج.
2. تصور الخلايا باستخدام مجهر متألق أو مجهر متحد البؤر.
   1. قم بتشغيل المجهر ومصدر ضوء الفلورسنت باتباع تعليمات الشركة المصنعة.
   2. حدد الهدف 10x أو 20x وضع طبق الثقافة على مرحلة المجهر.
   3. باستخدام عدسة المجهر ، ابحث عن الخلايا الموجودة أسفل مرشح 568 نانومتر وركز على الخلايا التي تعبر عن dsRedmito / mCherry reporter (الخلايا الحمراء).
   4. عد جميع الخلايا الحمراء في المجال المرئي وسجل الرقم.
   5. أثناء وجودك في نفس المجال المرئي ، قم بالتغيير إلى مرشحات 488 أو 512 (GFP أو YFP) ، وتابع حساب عدد الخلايا الحمراء الخضراء أيضا (إيجابية كوكب الزهرة أو إيجابية BiFC) ، وسجل الرقم.
   6. عد ما لا يقل عن 100 dsRedmito / mCherry - الخلايا الإيجابية من ثلاثة حقول بصرية فردية على الأقل.

Results

الشكل 1: نظرة عامة تخطيطية على سير العمل التجريبي.

< p class = "jove_content biglegend" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: تمايز الخلايا الوحيدة CD14 وتعدي MDM البشري. (أ) صور ممثلة للمجال الساطع للخلايا الوحيدة CD14 + من الدم المحيطي المعرض ل GM-CSF في الأيام 1 و 3...

Materials