نظام زراعة الأعضاء في الأمعاء خارج الجسم الحي لدراسة تفاعلات المضيف والجراثيم

الملخص

المصدر: Azriel, S., et al. نظام زراعة أعضاء الأمعاء المعوية لتحليل تفاعلات المضيف والميكروبات. J. Vis. Exp. (2021).

في هذا الفيديو ، نصف منهجية إنشاء نظام زراعة أعضاء الأمعاء خارج الجسم الحي لدراسة التفاعلات بين شظايا أنسجة الأمعاء في الفئران وبكتيريا الأمعاء المحددة. يتكون الجهاز من زوجين من منافذ الإدخال والإخراج ، الأول يربط تجويف الأنسجة المعوية ويزود التعليق البكتيري المحدد فيه ، والثاني يزود الوسائط باستمرار لآبار الجهاز للحفاظ على صلاحية الأنسجة خارج الجسم الحي.

البروتوكول

تمت مراجعة جميع الإجراءات التي تنطوي على نماذج حيوانية من قبل لجنة رعاية المؤسسية المحلية ومجلس المراجعة البيطرية JoVE.

< p class = "jove_title" >1. تحضير التجربة

1. تصنيع جهاز زراعة أعضاء الأمعاء (3 أيام)
   1. باستخدام طابعة ثلاثية الأبعاد ، قم بطباعة القوالب البلاستيكية القابلة لإعادة الاستخدام لجهاز زراعة الأعضاء (يحتوي الجهاز على 6 آبار ، مع 24 ثقبا صغيرا وكبيرا ، ولغطاء غطاء الجهاز).
      ملاحظة: يمكن استخدام هذه القوالب البلاستيكية لتصنيع العديد من الأجهزة.
   2. أدخل الإبر الحادة (22 جم و 18 جم) في الموضع المناسب داخل قالب الجهاز وصب ما يقرب من 20 جم من مزيج بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) (نسبة الوزن 1:10 ، القاعدة إلى المحفز) لمجموعة واحدة من الجهاز والغطاء.
   3. ضع القوالب في غرفة مفرغة لمدة 30 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء من مزيج PDMS.
   4. احتضان القوالب عند 55 درجة مئوية طوال الليل ، لإكمال بلمرة PDMS.
   5. عند ضبط PDMS ، اسحب الإبر من القالب وحرر جهاز الثقافة والغطاء بعناية من القوالب البلاستيكية.
   6. قم بإزالة بقايا PDMS من مخطط البئر باستخدام شفرة جراحية. قم بتوصيل جهاز PDMS وغطاء الجهاز على غطاء زجاجي (شرائح صغيرة مقاس 75 مم × 50 مم) باستخدام مادة لاصقة من السيليكون غير سامة واترك الأجزاء لتثبيتها طوال الليل (ضع الغراء على الجانب الأملس من الجهاز).
   7. أدخل اثني عشر إبرة 22 جيجا للتجويف واثني عشر إبرة 18 جراما للبئر. ثبت جميع الإبر في مكانها باستخدام السيليكون واتركها طوال الليل. أدخل إبرتين بوزن 18 جم في غطاء الغطاء لتدفق الهواء المناسب داخل وخارج جهاز زراعة أعضاء الأمعاء.
   8. افحص جميع الإبر بحثا عن التسريبات باستخدام حقنة مملوءة بالماء. تأكد من عدم وجود تسرب من الآبار عن طريق ملء الآبار بالماء.
   9. ضع عقدتين جراحيتين على كل إبرة 22 جم سيتم توصيلها بالقولون. ضع الجهاز والغطاء في كيس ورقي للأوتوكلاف وقم بتعقيمه في الأوتوكلاف.
2. وسط الثقافة (0.5 ساعة)
   1. في غطاء بيولوجي ، امزج ما يلي (في أنبوب سعة 50 مل): 37 مل من وسيط Dulbecco المعدل من Iscove (IMDM) ، و 10 مل من بديل مصل KSR ، و 1 مل من مكمل B27 ، و 0.5 مل من مكمل N2 ، و 0.5 مل من 1 M HEPES المؤقت ، و 0.5 مل من الأحماض الأمينية غير الأساسية.
   2. قم بتصفية وتخزين الوسط الكامل عند 4 درجات مئوية.
تحضير
3. الأنابيب والأدوات الجراحية
   1. قم بقص الطول المناسب للأنابيب لتجويف الإدخال ، وبئر الإدخال ، وتجويف الإخراج ، وبئر الإخراج (12 أنبوبا قصيرا و 12 أنبوبا طويلا). قم بتوصيل محول مناسب لكل جانب من جوانب الأنبوب.
   2. تحضير الأدوات الجراحية: مقص مستقيم ، ملقط رفيع 4x ، ملقط حاد 2x.
   3. ضع الأنابيب والأدوات الجراحية في كيس ورقي للأوتوكلاف وقم بتعقيمها باستخدام الأوتوكلاف.
4. تحضير المدخلات اللمعية (التحفيز المطلوب - البكتيريا ، البراز ، الأدوية ، إلخ).
   1. قبل التجربة ، حدد الحمل البكتيري للثقافة البكتيرية ، عن طريق التخفيفات التسلسلية ، والزراعة في ظل الظروف الهوائية و / أو اللاهوائية.
   2. بعد حساب الحمل البكتيري ، قم بتخفيف المزارع البكتيرية في وسط زراعة أنسجة معقمة للحصول على التركيز البكتيري المطلوب. بالنسبة لعينات البراز ، قم بالتصفية باستخدام مصفاة 100 ميكرومتر.
      ملاحظه: للتحفيز غير البكتيري (الأدوية ، المستقلبات ، إلخ) ، قم بتخفيف المادة إلى التركيز المطلوب باستخدام وسط زراعة الأمعاء.

2. إعداد إعداد التجربة

1. داخل حاضنة زراعة الأعضاء ، قم بتشغيل وحدة التسخين ، واضبطها على 37 درجة مئوية.
2. قم بإعداد المضخات بالإضافة إلى محاقن الإدخال والإخراج.
3. مدخلات وسط زراعة الأنسجة
   1. في غطاء التدفق البيولوجي أو الرقائقي ، املأ محاقن الإدخال بوسط ثقافة كامل. يعتمد الحجم النهائي على مدة التجربة ومعدل التدفق. عادة 1 مل / ساعة بالإضافة إلى وسيط إضافي للتطهير.
   2. قم بتوصيل الأنابيب بالمحاقن باستخدام محول قفل Luer. ضع المحاقن المملوءة في مضخات المحقنة.
   3. قم بتطهير محاقن الإدخال. تأكد من أن وسط البئر يتدفق من جميع الأنابيب إلى زجاج النفايات.
4. مدخلات اللمعة
   1. املأ محاقن الإدخال اللمعية بعلاج التحفيز (البكتيريا والأدوية وما إلى ذلك). يعتمد الحجم على مدة التجربة ومعدل التدفق (عادة 30 ميكرولتر / ساعة بالإضافة إلى وسيط إضافي للتطهير).
   2. قم بتوصيل الأنابيب بالمحاقن باستخدام محول قفل Luer. ضع المحاقن المملوءة في مضخات المحقنة.
   3. تطهير محاقن الإدخال. تأكد من أن التحفيز يتدفق من جميع الأنابيب إلى زجاج النفايات. احرص على عدم تلويث المحفزات المختلفة.
5. النواتج
   1. ضع المحاقن الفارغة في مضخات حقنة الإخراج (اضبط وضع المضخة على "السحب").
6. إعداد الجهاز
   1. اضبط المنظم الذي يتحكم في معدل تدفق خليط الغاز (95٪ O₂ + 5٪ CO₂) للحصول على تدفق لطيف وبسيط.
   2. افحص الجهاز في غطاء رقائقي.
   3. اغسل إبر الجهاز باستخدام IMDM معقم لغسل الإبر.
   4. أضف 500 ميكرولتر من وسط الاستزراع المعقم في كل بئر من الجهاز.
7. التحضير لتشريح الأنسجة
   1. ضع الأدوات الجراحية المعقمة داخل الغطاء الرقائقي.
   2. املأ حقنة سعة 10 مل ب IMDM معقم وقم بتوصيل إبرة معقمة (معقومة) 22 جم غير حادة لتنظيف القولون.

< p class = "jove_title" >3. ثقافات الأعضاء

1. تضحية الفئران وتشريح الأنسجة
   1. في غطاء رقائقي ، ضحي بالفئران التي تتراوح أعمارها بين 12 و 14 يوما عن طريق قطع الرأس. رش الفئران بنسبة 70٪ من الإيثانول وضع الفئران على طبق بلاستيكي.
   2. باستخدام مقص حاد وملقط ، قم بتشريح الفأر وإخراج الجهاز الهضمي من المعدة إلى فتحة الشرج عن طريق قطع جميع الدهون والأنسجة الضامة. نقطع القولون ونضعه على طبق جديد.
      ملاحظه: قلل من ملامسة أنسجة القولون. لا تلمس الجزء الأوسط من أنسجة القولون. امسك الأنسجة برفق وفقط عند حواف الأنسجة.
غسل
2. القولون وغسلها
   1. تحت مجهر التشريح ، اغسل محتوى القولون برفق باستخدام IMDM معقم (في الجانب القريب) باستخدام حقنة 10 مل محضرة (الخطوة 2.7.2). بعد إزالة البراز من أنسجة الأمعاء ، ضع القولون في صفيحة جديدة مكونة من 6 آبار مملوءة ب 0.5 مل من IMDM المعقم.
3. توصيل القولون بالجهاز
   1. خذ الأنسجة ، وقم بتوصيلها بعناية بإبرة 22 جم ، وقم بعمل ربطة عنق محكمة مع الخيطين. في هذه المرحلة ، من الضروري الحفاظ على الاتجاه الصحيح للقولون إلى تدفق التجويف (قريب = مدخلات ، بعيد = مخرج). كرر الخطوات 3.2-3.3 لجميع الأنسجة الستة.
   2. تحقق من أن أقفال إبرة الإدخال Luer فارغة من الوسط. إذا لم يكن كذلك ، فقم بإفراغها. أضف محفزات إلى قفل Luer لإبرة الإدخال (لتجنب دخول فقاعات الهواء إلى التجويف). كرر هذه الخطوة لكل قولون مع التحفيز المناسب.
   3. تأكد من توصيل جميع المناديل ووضع غطاء الغطاء أعلى الجهاز.
4. توصيل جهاز زراعة الأعضاء بالمضخات
   1. ضع الجهاز في الغرفة المسخنة مسبقا التي يتم التحكم في درجة حرارتها (37 درجة مئوية).
5. توصيل تدفق الغاز
   1. قم بتوصيل محول الغاز بغطاء الغطاء باستخدام إبرة الإدخال المناسبة.
   2. قم بتوصيل أنابيب الإدخال والإخراج بالجهاز.
      ملاحظه: قم بتوصيل جانب القولون القريب بأحواض الإدخال.
6. قم بتطهير التجويف بمدخلات التحفيز.
   1. قم بتدفق التحفيز اللمعي برفق عبر القناة الهضمية وتحقق من التدفق المتوسط في أنابيب الإخراج.
   2. اغسل الوسط الخارجي.
   3. اغسل الوسط الخارجي 3 مرات (اضبط المضخات بمعدل 600 ميكرولتر / دقيقة لكل من بئر الإدخال والإخراج). تستغرق كل غسلة 1 دقيقة (بدءا من إفراغ البئر).
7. ابدأ التجربة.
   1. ابدأ تشغيل المضخات بالمعدلات التالية:
      معدل التدفق: تجويف: المدخلات - 30 ميكرولتر / ساعة ، الإخراج - 35 ميكرولتر / ساعة < br / > الوسيط الخارجي: المدخلات - 1000 ميكرولتر / ساعة ، الإخراج - 950 ميكرولتر / ساعة < br / > ملاحظه: يمكن أن يتراوح وقت التجربة بين 30 دقيقة إلى 24 ساعة.
8. نهاية التجربة (حتى 24 ساعة لمزارع أعضاء القولون)
   1. افصل جميع الأنابيب عن الجهاز.
   2. افصل الأنسجة عن الإبر واستمر في القراءات المطلوبة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات جهاز 18 قياس إبرة حادة ماكماستر 75165a754 22-قياس إبرة حادة ماكماستر 75165a758 جميع الأغراض لاصقة مانع التسرب 100٪ سيليكون DAP 688 ريال مجفف فراغ مكعب VDC-21 + 2 أرفف AAAD4021 شريحة زجاجية بسمك 1 مم كورنينج 2947-75 × 50 حاضنة صغيرة im-10 AAH24315K مضخة فراغ MPC 301E السادس -412711 البلاستيك سريع الدوران أنبوب اقتران المقابس ماكماستر 51525 كيلو 121 البلاستيك سريع الدوران أنبوب اقتران المآخذ ماكماستر 52525 كيلو 211 سيلجارد 184 سيليكون مطاط معدني داو بولي ديميثيل سيلوكسان ، PDMS انابيب ماكماستر 6516 تي 11 زورتراكس M200 زورتراكس زورتراكس Z-SUITE، أوتوديسك فيوجن 360 مواد Zortrax M200: z-ultrat زورتراكس متوسط مكمل B27 (50x) ، خال من المصل T ثيرمو فيشر العلمي 17504044 وسط Dulbecco المعدل من Iscove مع الفينول الأحمر (1x) ثيرمو فيشر العلمي 12440061 عازلة HEPES (1 متر) ثيرمو فيشر العلمي 15630056 مصل خروج المغلوب ثيرمو فيشر العلمي 10828028 ملحق N2 (100x) ثيرمو فيشر العلمي A1370701 الأحماض الأمينية غير الأساسية (100x) ثيرمو فيشر العلمي 11140035 الأدوات الجراحية مقص كبير أسلتك 11-00-10 ملقط حاد ف.س.ت 11297-10 خيط جراحي مضفر بالحرير SMI 8010 جرام مقص مستقيم ف.س.ت 14091-09 ملقط رفيع ف.س.ت 11051-10 نظام الأعضاء مرشح 0.1 ميكرومتر جين الحياة مرشح 0.22 ميكرومتر جين الحياة 5 مل حقنة Luer-Lock ب - د 309649 جرينف مجهر ستيريو زييس ستيمي 305 إعادة تدوير سخان الهواء الدقيق "CUBE" مكعب -2 - ليس مضخة حقنة شركة نيو إيرا لأنظمة المضخات نب ني 1600 م