تحليل تأثير مستحضرات منتجات التبغ على إنتاج السيتوكين عن طريق التلوين داخل الخلايا وقياس التدفق الخلوي

الملخص

المصدر: Arimilli، S. et al.، طرق لتقييم السمية الخلوية وتثبيط المناعة لمستحضرات منتجات التبغ القابلة للاحتراق.J. Vis. Exp.(2015)

يوضح هذا الفيديو تأثير مستحضرات منتجات التبغ ، TPPs ، على إنتاج السيتوكين من خلايا الدم المحيطي البشرية أحادية النواة باستخدام قياس التدفق الخلوي. علاج الخلايا باستخدام TPP يقلل من تنظيم إنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات ، والتي يتم تقديرها بعد تحفيز عديدات السكاريد الدهنية ، يليها تلطيخ المناعة وتحليل قياس التدفق الخلوي.

البروتوكول

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.

< p class = "jove_title" >1. إعداد WS-CM

1. قم بتوليد وسط كامل مكيف للدخان (WS-CM) كما هو موضح سابقا.
   1. قم بإعداد WS-CM عن طريق تمرير الدخان من أربع سجائر مرجعية 3R4F عبر معهد روزويل بارك التذكاري (RPMI) 1640 وسط بدون أحمر الفينول باستخدام نظام التدخين التالي: 35-60-2 ، حجم النفخة بالممل ، فاصل النفخة في الثانية ، ومدة النفخة في الثانية ، على التوالي. يولد كل مستحضر عينة 20 مل.
2. أنبوب (أنبوب) الملصقات مع التاريخ والوقت المكتمل واسم ورقم السجائر قم بتخزين 500 ميكرولتر عند -80 درجة مئوية فور اكتمال التدخين.
3. تحليل حصص WS-CM المجمدة لتحديد مستويات النيكوتين والنيتروزامين الخاص بالتبغ والهيدروكربونات العطرية متعددة الحلقات كما هو موضح سابقا.

< p class = "jove_title" >2. عزل خلايا الدم المحيطية أحادية النواة ، PBMCs

1. جمع الدم الطازج من المتبرعين الأصحاء (غير المستهلكين لمنتجات التبغ) عزل ثنائي الفينيل متعدد الكلور من الدم الطازج كما هو موضح أدناه.
   1. قبل وصول كيس الدم ، جهز زجاجة سعة 500 مل ، ومقص ، ومخزن عازل ، ومحلول ملحي مخزن بالفوسفات (DPBS) (RT) من Dulbecco في غطاء مزرعة خلية من مستوى السلامة البيولوجية 2 (BSL-2). يجب حماية المخزن المؤقت للعزل من الضوء.
   2. أمسك كيس الدم رأسا على عقب واقطع الأنبوب أسفل المكان الذي تم تثبيته فيه مباشرة مع ترك 3 سم على الأقل من الأنابيب.
   3. قم بإزالة الغطاء من الزجاجة سعة 500 مل وأمسك الأنبوب فوق فتحة الزجاجة. التقط كيس الدم واقلبه للسماح للدم بالتدفق بحرية من الكيس إلى الزجاجة حتى يفرغ الكيس. اسمح للدم بالتدفق إلى الجدار الداخلي للزجاجة مقابل الأسفل مباشرة لتجنب تكوين فقاعات.
   4. صب عازلة العزل في الزجاجة بنسبة 1: 5 من عازلة العزل إلى الدم. أغطي الزجاجة بإحكام واقلبها برفق ، من طرف إلى طرف ، 10 مرات. اترك الزجاجة في غطاء مزرعة الخلية لتحتضانها مع إطفاء الأضواء ، لمدة 1 ساعة في RT.
   5. سوف تتراكم طبقة فاتحة بلون القش فوق الدم. قم بإزالة هذه الطبقة باستخدام ماصة مصلية سعة 25 مل في أنابيب مخروطية سعة 50 مل. قد تختلف الكمية التي تم جمعها من 50 إلى 300 مل ، اعتمادا على الشخص الذي تبرع بالدم.
   جهاز
   6. الطرد المركزي للأنابيب عند 200 × جم لمدة 10 دقائق في RT.
   7. استنشق المادة الطافية الشفافة ، تاركة الحبيبات ذات اللون الدموي الداكن. ستكون الحبيبات فضفاضة ولكنها لزجة.
   8. ماصة 3 مل من العزل في أنابيب مخروطية سعة 15 مل.
   9. إلى الحبيبات المعلقة ، أضف 20 مل من DPBS لكل 50 مل من السائل بلون القش الذي تم جمعه في الخطوة 2.1.5. دوامة للخلط جيدا ، وتوحيد السائل المعلق من أنابيب متعددة. يحتوي هذا السائل على خلايا الدم العالقة.
   10. باستخدام ماصة النقل ، انقل 5 مل من خلايا الدم العالقة إلى 3 مل من عازلة العزل في الخطوة 2.1.8. قم بإمالة الأنبوب المخروطي سعة 15 مل الذي يحتوي على تعليق الخلية ببطء ورفق لإنشاء طبقتين منفصلتين. قم بالطرد المركزي للأنابيب عند 400 × جم لمدة 40 دقيقة عند RT بأقل تسارع وبدون فرامل.
   11. استخدم ماصة نقل لإزالة الطبقة الوسطى الغائمة الناتجة (طبقة مصفرية) التي تحتوي على PBMCs في أنبوب مخروطي سعة 50 مل. تجنب رسم طبقات واضحة أخرى تحته. لا تنقل أكثر من 25 مل إلى كل أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
   12. أضف 25 مل من المخزن المؤقت للتشغيل البارد (أو أكثر لملء الحجم المتبقي بالكامل من الأنبوب المخروطي سعة 50 مل) لغسل الخلايا. الطرد المركزي للخلايا عند 400 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
   13. أعد تعليق الحبيبات مع 10 مل تشغيل المخزن المؤقت. يحتوي هذا على PBMCs. عد الخلايا واستخدمها على الفور أو ضعها على الجليد للتجميد.

< p class = "jove_title" >3. تجميد وذوبان PBMCs

1. الطرد المركزي لخلايا الدم السطحية أحادية النواة (PBMCs) التي تم جمعها في الخطوة 2.1.13 لمدة 10 دقائق عند 400 × جم.
2. املأ وعاء التجميد بكحول الأيزوبروبيل وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
   أنذر: كحول الأيزوبروبيل قابل للاشتعال وسام بشكل حاد.
3. أعد تعليق الحبيبات باستخدام RPMI 1640 المتوسط (4 درجات مئوية) الذي يحتوي على 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO). هذا هو وسط التجميد RPMI 1640. أعد تعليق الحبيبات بكمية من وسط التجميد مما سيؤدي إلى تعليق يحتوي على حوالي 5 × 10⁷ خلايا / مل. سيختلف عدد الخلايا المتاحة للتجميد.
4. قم بتوزيع 1 مل من أجزاء معلق الخلية في أنابيب التبريد سعة 2 مل وضع الأنابيب المبردة في حاوية التجميد. ضع حاوية التجميد مع أنابيب التبريد في الفريزر عند -80 درجة مئوية لتخزين O / N ثم قم بإزالة الأنابيب المبردة ونقلها للتخزين في الفريزر المبرد بين -150 درجة مئوية إلى -190 درجة مئوية.
5. قم بإزالة أنبوب التبريد من التخزين المبرد وقم بإذابة الثلج بسرعة مع تحريك لطيف في حمام مائي عند 37 درجة مئوية.
6. انقل PBMCs المذابة على الفور في أنبوب التبريد إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع 10 مل RPMI 1640 متوسط كامل (4 درجات مئوية) يحتوي على 10٪ FBS و 1٪ قلم / بكتيريا عقدية و 1٪ L-جلوتامين. يجب نقل محتويات أنبوب التبريد المذاب في أسرع وقت ممكن للحصول على أقصى قدر من صلاحية الخلية.
7. جهاز الطرد المركزي PBMCs عند 400 × جم لمدة 10 دقائق.
8. أعد تعليق الحبيبات بوسط كامل 5 مل RPMI 1640 وعد الخلايا.
9. قم بقياس قابلية الخلية للبقاء بالطرق المعمول بها مثل طريقة استبعاد التريبان الأزرق. بشكل عام ، تبلغ صلاحية الخلية بهذه الطريقة حوالي 90 - 95٪. أصبحت PBMCs جاهزة الآن للاستخدام في التجارب.

4. التلوين داخل الخلايا وقياس التدفق الخلوي

ملاحظة: التخفيفات المدرجة هنا هي لغرض هذه الدراسة. يمكن تعديل التخفيفات وفقا لذلك.

1. قم بتخفيف WS-CM في صفيحة مكونة من 96 بئرا باستخدام RPMI متوسط كامل إلى حجم إجمالي قدره 100 ميكرولتر / بئر بتركيز 0.3 و 1.56 و 3 و 5 ميكروغرام / مل من وحدات النيكوتين المتساوية.
2. في نفس اللوحة ، قم بتخفيف النيكوتين إلى التركيزات التالية: 2 و 10 و 50 و 100 و 500 و 2000 و 4000 ميكروغرام / مل
   أنذر: النيكوتين سام للغاية وخطير بيئيا.
3. أضف 100 ميكرولتر من PBMCs المعلقة في وسط RPMI الكامل بتركيز 1 × 10⁶ خلايا / بئر. سيكون الحجم الإجمالي للخلايا بالإضافة إلى WS-CM أو النيكوتين 200 ميكرولتر / بئر.
4. غطي الطبق واحتضنه لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
5. اغسل الخلايا في RT عن طريق الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 3 دقائق ، وشفط المادة الطافية ، وتدوير الجزء السفلي من اللوحة مع تغطية اللوحة ، وأخيرا إعادة تعليق الخلايا ب 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت المثلج ، وكرر خطوة الغسيل مرة أخرى.
6. أضف 200 ميكرولتر من وسط RPMI الكامل إلى الطبق ، وكرر خطوة الغسيل مرة أخرى.
7. قم بإعداد تركيزات العمل البالغة 2 ميكرولتر / مل GolgiPlug و 10 ميكروغرام / مل LPS باستخدام وسيط RPMI الكامل وأضف 200 ميكرولتر إلى كل بئر.
8. احتضان اللوحة لمدة 6 ساعات عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
9. في نهاية الخطوة 9.8 ، اغسل الخلايا بمخزن مؤقت قيد التشغيل (4 درجات مئوية) وقم بالدوران عند 300 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
10. أضف 100 ميكرولتر من Cytofix إلى كل بئر واحتضنه لمدة 20 دقيقة عند 4 درجات مئوية.
11. اغسل الخلايا 3 مرات كما هو موضح في الخطوة 9.9 باستخدام 1x Permwash (4 درجات مئوية) عند 300 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
12. أضف 45 ميكرولتر من 1x Cytoperm إلى كل بئر متبوعا ب 5 ميكرولتر من كل من أحد الأجسام المضادة التالية لكل بئر: TNF-α-Alexa Fluor 488 ، IFN-γ V500 ، MIP-1α PE. احتضان عند 4 درجات مئوية لمدة 30 دقيقة.
13. اغسل الخلايا مرتين كما هو موضح في الخطوة 9.9 باستخدام 1x Permwash (4 °C) ومرة واحدة باستخدام عازل تشغيل (4 درجات مئوية) عند 300 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
14. أعد تعليق الخلايا ب 200 ميكرولتر من 2٪ بارافورمالدهيد (4 درجات مئوية). انقل الخلايا إلى أنابيب 12 × 75 مم ، وقم بتحليل العينات على مقياس التدفق الخلوي.
    أنذر: بارافورمالدهيد مادة أكالة وسامة بشكل حاد وتشكل خطرا على الصحة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 12 × 75 أنبوب بي دي فالكون 352058 15 مل أنابيب مخروطية الشكل كورنينج هاتف: 430790 2 مل الأنابيب الدقيقة أكسايجن MCT-150-C-S السجائر المرجعية 3R4F جامعة كنتاكي ، كلية الزراعة 3R4F 50 مل أنابيب مخروطية الشكل كورنينج 430828 زجاجة 500 مل كورنينج 430282 96 بئر لوحة مسطحة القاع تيرمو نونك 439454 غطاء مزرعة الخلية الترمو: العلمية 1300 السلسلة A2 الطرد المركزي إيبندورف 58110 ص Cytofix / Cytoperm (Permwash) BD Biosciences 555028 الاشتعال FBS سيجما ألدريتش F2442 وحدة التصفية نالجين 156-4020 مقياس التدفق الخلوي BD Biosciences FACS كانتو II 8 ألوان ، في Ex 405 و Em785. مقياس التدفق الخلوي BD Biosciences FACS كاليبور 4 ألوان في Ex 495 و Em 785. برنامج تحليل قياس التدفق الخلوي نجمة الشجرة فلولجو حاوية التجميد نالجين 5100-0001 يحتوي على DMSO ، مهيج جوجلبليج BD Biosciences 555029 مادة مسرطنة ومهيجة ومسببة للتآكل IFN-γ V-500 الجسم المضاد BD هورايزون 561980 محسس للبشرة المخزن المؤقت للعزل Isolymph ، CTL Scientific Corp. 1114868 سائل قابل للاشتعال ، مهيج كحول الأيزوبروبيل سيجما ألدريتش W292907 ل-جلوتامين جيبكو لايف تكنولوجيز هاتف: 25030-081 لبس سيجما ألدريتش L2630 MIP1-α PE الأجسام المضادة BD Pharmingen 554730 سمية حادة عن طريق الفم نيكوتين سيجما ألدريتش N3876 السمية الحادة ، المخاطر البيئية بارافيلم بيميس "م" بارافورمالدهيد سيجما ألدريتش ص 6148 قابل للاشتعال ، تهيج الجلد القلم / البكتيريا العقدية جيبكو لايف تكنولوجيز 15140-122 RPMI 1640 جيبكو لايف تكنولوجيز 11875-093 تشغيل المخزن المؤقت MACS تشغيل العازلة ، Miltenyi Biotech 130-091-221 TNF-α Alexa Fluor 488 الأجسام المضادة بيو ليجند 502915 نقل الماصة فيشر ساينتيك 13-711-20