تخليق الأغشية الحيوية في المختبر بواسطة المكورات العنقودية الذهبية

الملخص

المصدر: Rana ، P. S. et al. ، فحوصات موحدة في المختبر لتصور وتحديد التفاعلات بين العدلات البشرية والمكورات العنقودية الذهبية الأغشية الحيوية. J. Vis. Exp. (2022)

في هذا الفيديو ، نوضح تحضير الأغشية الحيوية في المختبر بواسطة S. aureus في صفيحة متعددة الآبار مطلية ب poly-L-Lysine. يمكن استخدام اللوحة المشكلة من الأغشية الحيوية في التجارب النهائية.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. تحضير الفيلم الحيوي في المختبر

1. احصل على مستعمرات معزولة من المكورات العنقودية الذهبية من مخزون محفوظ بالتبريد باستخدام تقنية صفيحة الخطوط على صفيحة أجار غنية بالمغذيات ، مثل أجار الصويا Tryptic (انظر جدول المواد).
2. قم بتغطية الآبار الفردية لصفيحة 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من 0.001٪ (حجم / حجم) بولي L-Lysine (PLL) المخفف في H₂O معقم واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اترك الآبار تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظه: يتم تنفيذ جميع خطوات الشفط في البروتوكول باستخدام مصيدة الشفط بمساعدة الفراغ ما لم ينص على خلاف ذلك.
3. قم بإعداد مزرعة ليلية عن طريق تلقيح مستعمرة من المكورات العنقودية الذهبية في الحد الأدنى من الوسائط الأساسية ألفا (MEMα) مكملة ب 2٪ جلوكوز واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، مع رجها عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 16-18 ساعة.
4. قم بتخفيف المزرعة الليلية عن طريق نقل 50 ميكرولتر إلى 5 مل من MEMα الطازج المكمل بالغلوكوز بنسبة 2٪ واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، مع الرج عند 200 دورة في الدقيقة ، حتى منتصف المرحلة اللوغاريتمية ، بشكل عام بين الكثافة البصرية 600 (OD_600nm) من 0.5-0.8. استخدم MEMα لتطبيع الثقافة اللوغاريتمية المتوسطة إلى OD_600nm من 0.1.
5. انقل 150 ميكرولتر من المزرعة الطبيعية إلى كل بئر من صفيحة 96 بئر المعالجة ب PLL. احتضان بشكل ثابت لمدة 18-20 ساعة في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية
   ملاحظه: يمكن أيضا زراعة الأغشية الحيوية بتنسيقات أخرى مثل الشرائح ذات القنوات μ (انظر جدول المواد).
6. استنشاق المادة الطافية لإزالة الخلايا العوالق. اغسل الكتلة الحيوية المتبقية برفق ب 150 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) لإزالة الخلايا غير المتصلة. أضف HBSS بالتنقيط لتجنب تعطيل الأغشية الحيوية.
   ملاحظه: أثناء شفط المادة الطافية و HBSS أثناء الغسيل ، اترك ما يكفي من السائل (طافي أو HBSS) في الآبار التي تحتوي على الأغشية الحيوية بحيث لا يزال الأغشية الحيوية مغمورا. هذا يمنع تعطيل بنية الأغشية الحيوية عند إضافة HBSS بالتنقيط لغسل الأغشية الحيوية.
7. كرر الخطوة 1.6 مرتين أخريين على الأقل لإزالة جميع الخلايا العوالق. في هذه المرحلة ، تكون الأغشية الحيوية جاهزة للتجارب الفورية في المصب
   ملاحظه: إذا لم يتم استخدام الأغشية الحيوية في تجارب العدلات ، فيمكن استبدال HBSS بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). يفضل HBSS على PBS حيث يحتوي HBSS على مكونات ، بما في ذلك الجلوكوز ، توفر الظروف المثلى لتنشيط العدلات.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات BD باكتو مرق الصويا الترابطي دينار بحريني DF0370-07-5 يمزج مع 1.5٪ أجار لعمل أجار الصويا Tryptic ألواح البوليسترين ذات القاع المسطح 96 بئر كوستار 3370 ريال محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) 1x كورنينج سيلجرو 21-022-السيرة الذاتية بدون الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول الأحمر محلول بولي إل ليسين سيغما P4707-50 مل أطباق بيضاء غير شفافة سعة 96 بئرا صقر 353296 زراعة الأنسجة المعالجة ولوحة القاع المسطحة الحد الأدنى من الوسائط الأساسية (MEM) Alpha 1x جيبكو 41061-029