تقنية في المختبر لتحفيز الخلايا الليمفاوية عن طريق البكتيريا المسببة للأمراض

الملخص

المصدر: Dousha, L., et al. تقييم الاستجابات المناعية التنفسية للمستدمية النزلية. J. Vis. Exp. (2021)

يوضح هذا الفيديو تقنية في المختبر لتحفيز الخلايا الليمفاوية عن طريق المستدمية النزلية غير القابلة للكتابة (NTHi) وتقييم الاستجابة المناعية. يؤدي احتضان خلايا الدم المحيطية أحادية النواة المعزولة (PBMCs) مع NTHi إلى تحفيز الخلايا البكتيرية للخلايا الليمفاوية التائية ، مما يؤدي إلى إنتاج السيتوكينات. عند تثبيط إفراز السيتوكينات ، يتم إجراء تلطيخ التألق المناعي للكشف عن السيتوكينات المتراكمة داخل الخلايا في الخلايا الليمفاوية التائية المحفزة.

البروتوكول

< ص الفئة = "jove_title">1. تحضير المستضد

ملاحظة: يمكن استخدام ثلاثة مستحضرات مستضدية مختلفة لتقييم الاستجابة المناعية ل Hi. هذه هي 1) مكون تحت الخلوي (عادة من جدار الخلية البكتيرية) ؛ 2) البكتيريا المقتولة والمعطلة ؛ و 3) البكتيريا الحية. تحديد استخدام كل مستحضر مستضد قبل بدء أي تجارب.

1. المكونات تحت الخلوية
   1. الحصول على مكونات تحت الخلوية من المصادر ، بما في ذلك المستحضرات التجارية والمكونات المطورة داخليا و / أو من محققين آخرين.
      ملاحظه: يمكن استخدام المكونات الخلوية الفرعية عادة من جدار الخلية البكتيرية وتشمل بروتينات الغشاء الخارجي مثل P6 و lipooligosaccharide (LOS). عادة ما يتم اشتقاق هذه المكونات تحت الخلوية في مراكز متخصصة. وصف كيفية صنعها خارج نطاق هذه المقالة. يوصى بالاتصال المباشر بالخبراء في هذا المجال للحصول على هذه المكونات.
2. البكتيريا المقتولة / المعطلة
   1. الحصول على البكتيريا من العينة المناسبة (على سبيل المثال ، البلغم أو تنظير القصبات). تأكد من السلالة على أنها الملوية النزلية باستخدام مختبر علم الأحياء الدقيقة المناسب. قم بإجراء طباعة عينات الملوية النزلية للتأكد من أنها غير قابلة للكتابة (NTHi ، بواسطة مختبر متخصص في علم الأحياء المجهرية).
   2. للحصول على مستضد تمثيلي ، استخدم سلالات NTHi متعددة (5 على الأقل ، كل منها بنفس الكمية تقريبا) لصنع مستضد مجمع. قم بتخزين السلالات عند -70 درجة مئوية في مرق الجلسرين في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
      ملاحظه: في هذه التجربة ، تم استخدام عشر سلالات متميزة.
   3. قم بإذابة السلالات (أنبوب طرد مركزي دقيق واحد في كل مرة) على أطباق أجار الشوكولاتة وتنمو بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. أضف البكتيريا إلى 500 ميكرولتر من المحلول الملحي المخزن بالفوسفات (PBS) واغسلها مرتين (تدور عند 300 × جم لمدة 5 دقائق). استخدم معيار MacFarland أو مقياس الطيف الضوئي لنقل NTHi إلى تركيز 10⁸ مل (باستخدام حاوية 5 مل أو ما يعادلها).
   4. تعمل الحرارة على تعطيل البكتيريا عن طريق وضعها في حمام مائي عند درجة حرارة 56 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   5. صوتنة البكتيريا باستخدام إعداد صوتنة مستمر بسرعة منخفضة إلى متوسطة المدى لمدة 30 ثانية.
   6. اقتبس الحجم المناسب من العينات في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. للحصول على عينة من 10⁸ مل ، استخدم كميات 50 ميكرولتر (أي 20 عينة لكل مل) ، وقم بتجميدها عند -70 درجة مئوية حتى الحاجة.
3. البكتيريا الحية
   1. أولا ، قم بتمييز البكتيريا الحية كما هو مذكور في الخطوة 1.2.1. استخدم سلالة واحدة جيدة التميز. تأكد من تخزين السلالة أيضا في مرق الجلسرين عند -70 درجة مئوية كاحتياطي.
   2. تنمو البكتيريا على الوسائط المخصبة مثل أطباق أجار الشوكولاتة أو في المرق.
      1. لاستخدام أطباق أجار الشوكولاتة ، انشر البكتيريا لمدة لا تقل عن 3-4 أيام باستخدام موزعات معقمة.
      2. بدلا من ذلك ، استخدم مرق تسريب قلب الدماغ (BHI) المخصب بالعوامل X (هيمين) و V (β-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد) لزراعة البكتيريا. تلقيح NTHi من الألواح الليلية في 5-10 مل من مرق BHI المكمل بكل من الهيمين و β-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (كلاهما 10 ميكروغرام / مل) وزراعته طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ بنسبة 5٪.
         ملاحظه: هذا له ميزة التكاثر ، وعدد وحدات تكوين المستعمرات الأعلى (CFU) ، وجميع البكتيريا في مرحلة مماثلة من نمو السجل (على الألواح ، يمكن أن تكون صلاحية البكتيريا أكبر اعتمادا على الموضع في الثقافة).
   3. استخدم تعدد العدوى (MOI) من 100 بكتيريا في خلية واحدة لاستنباط استجابة مناعية قوية مع الحفاظ على قابلية الخلية. استخدم معيار ماكفارلاند أو مقياس الطيف الضوئي لتقييم عدد البكتيريا.
   4. تأكد من أن الوسائط المستخدمة في فحوصات NTHi الحية خالية من أي مصل بشري ، لأن هذا سيقتل البكتيريا. عينات مصل (على سبيل المثال ، مصل ربلة الساق الجنينية) لا تسبب أي مشاكل بشكل ><عام. ملاحظه: استخدم الطرق الموضحة أدناه لتحليل عينات الأنسجة القياسية مثل الدم المحيطي وعينات تنظير القصبات (خاصة غسل القصبات الهوائية (BAL)) وأنسجة الرئة المقطوعة. احتضان العينات بمستضد Hi من 10 دقائق إلى 24 ساعة أو أكثر.

< p class = "jove_title" >2. تقييم وظيفة الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي

1. استخدم مستحضرات الدم الكامل أو الخلايا أحادية النواة لمقايسات قياس التدفق الخلوي.
2. الحصول على عينات من كل موضوع عن طريق بزل الوريد. اجمع 4 مل من الدم من الوريد المحيطي في أنبوب الهيبارين الليثيوم وقسم العينات إلى حصص للتحكم وتحفيز المستضد.
3. أضف الأجسام المضادة التكلفة (anti-CD28 و CD49d ، 1 ميكرولتر / مل) إلى كلتا العينتين. أضف NTHi إلى عينة المستضد واحتضنه عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 1 ساعة. لتحضير NTHi المقتول ، أضف 200 ميكرولتر من المستضد إلى 2 مل من الدم. بالنسبة إلى NTHi الحي ، أضف خلايا NTHi الحية بمعدل 100: 1 إلى الخلايا البيضاء (كما تم قياسها بواسطة مقياس كثافة الدم).
4. أضف عامل حجب جولجي Brefeldin A (10 ميكرولتر / مل) إلى العينات واحتضنها لمدة 5 ساعات أخرى
   ملاحظه: يؤدي سد جهاز جولجي إلى منع تصدير السيتوكينات خارج الخلية.
5. إذا تم استخدام الدم الكامل ، فقم بتحلل كريات الدم الحمراء باستخدام 0.8٪ كلوريد الأمونيوم لترك الكريات البيض فقط في المحلول. إصلاح الكريات البيض باستخدام 500 ميكرولتر من 1٪ -2٪ بارافورمالدهايد لمدة 1 ساعة.
6. عد الخلايا عن طريق مقياس الدم ، ونفخ 10⁶ خلايا مع 100 ميكرولتر من 0.1٪ سابونين لمدة 15 دقيقة ، واحتضان الخلايا بالأجسام المضادة المسماة بالفلورسنت. اغسل الخلايا وقم بتحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
   ملاحظه: ستكون كمية الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية محددة لكل سيتوكين. اتبع تعليمات الشركة المصنعة. عادة ، سيتم تلطيخ 10⁶ خلايا في 100 ميكرولتر من المحلول لمدة ساعة واحدة. ستكون معظم الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها تجاريا كافية لإجراء 25-100 اختبار.
7. حدد نسبة الخلايا المستجيبة للمستضد عن طريق بوابات مجموعة الخلايا الليمفاوية ذات الصلة (الخلايا مسورة بواسطة CD45 ، ثم بواسطة CD3 ، ولاحقا بواسطة تعبير CD4 أو CD8) كما هو موضح في الشكل 1. قم بإجراء تلطيخ الخلفية على الخلايا غير المحفزة لتحليل جميع السيتوكينات. فحص 100,000 خلية لتحليل كل سيتوكين لكل من الخلايا المحفزة والتحكم.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: إنتاج السيتوكين في أنسجة الرئة. يتم تحليل الخلايا أولا للتعبير عن علامة الكريات البيض CD45 (A) باستخدام قياس التدفق الخلوي. ثم يتم تحليل هذه المجموعة بشكل أكبر لتعبير CD3 (B) وتعبير CD4 / CD8 (C). يتم تقييم خلايا CD3 / CD4 + لإنتاج السيتوكين داخل الخلايا في العينات الضابطة (D) و NTHi المحفزة (E).

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات كلوريد الأمونيوم سيجما ألدريتش هاتف: 213330 بريفلدين سيجما ألدريتش ب 6542 سي دي 28 ثيرموفيشر 16-0289-81 CD49d ثيرموفيشر 534048 سابونين سيجما ألدريتش 8047152