$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تشمل مشاركين بشريين وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية والوطنية والدولية لرفاهية الإنسان وتمت مراجعتها من قبل مجلس المراجعة المؤسسية المحلي.
< ص الفئة = "jove_title">
1. تحضير المستضد
- البكتيريا الحية
- أولا ، قم بتمييز البكتيريا الحية. الحصول على البكتيريا من العينة المناسبة (على سبيل المثال ، البلغم أو تنظير القصبات). تأكد من السلالة على أنها المستدمية النزلية باستخدام مختبر علم الأحياء الدقيقة المناسب. قم بإجراء طباعة عينات الملوية النزلية للتأكد من أنها غير قابلة للطباعة (بواسطة مختبر متخصص في علم الأحياء الدقيقة). استخدم سلالة واحدة جيدة التميز. تأكد من تخزين السلالة أيضا في مرق الجلسرين عند -70 درجة مئوية كاحتياطي.
- تنمو البكتيريا على الوسائط المخصبة مثل أطباق أجار الشوكولاتة أو في المرق.
- لاستخدام أطباق أجار الشوكولاتة ، انشر البكتيريا لمدة لا تقل عن 3-4 أيام باستخدام موزعات معقمة.
- بدلا من ذلك ، استخدم مرق تسريب قلب الدماغ (BHI) المخصب بالعوامل X (هيمين) و V (β-نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد) لزراعة البكتيريا. تلقيح الملوية النزلية غير القابلة للكتابة (NTHi) من الصفائح الليلية في 5-10 مل من مرق BHI المكمل بكل من الهيمين وثنائي النوكليوتيد الأدينين β-نيكوتيناميد (كلاهما 10 ميكروغرام/مل) وزراعته طوال الليل عند 37 درجة مئوية في حاضنة ثاني أكسيد الكربون 5٪ ، ثاني أكسيد الكربون2.
ملاحظه: هذا له ميزة التكاثر ، وعدد وحدات تكوين المستعمرات الأعلى (CFU) ، وجميع البكتيريا في مرحلة مماثلة من نمو السجل (على الألواح ، يمكن أن تكون صلاحية البكتيريا أكبر اعتمادا على الموضع في الثقافة).
- استخدم تعدد العدوى (MOI) من 100 بكتيريا في خلية واحدة لاستنباط استجابة مناعية قوية مع الحفاظ على قابلية الخلية. استخدم معيار ماكفارلاند أو مقياس الطيف الضوئي لتقييم عدد البكتيريا.
- تأكد من أن الوسائط المستخدمة في فحوصات NTHi الحية خالية من أي مصل بشري ، لأن هذا سيقتل البكتيريا. عينات مصل (على سبيل المثال ، مصل ربلة الساق الجنينية) لا تسبب أي مشاكل بشكل عام. < / >
ملاحظة: استخدم الطرق الموضحة أدناه لتحليل عينات الأنسجة القياسية مثل الدم المحيطي وعينات تنظير القصبات (خاصة غسل القصبات الهوائية (BAL)) وأنسجة الرئة المقطوعة. احتضان العينات بمستضد Hi من 10 دقائق إلى 24 ساعة أو أكثر.
فئة
2. تقييم وظيفة الخلايا الليمفاوية / الوسطاء الالتهابيين في أنسجة الرئة
- ليس من الممكن عادة الحصول على ما يكفي من الخلايا الليمفاوية من تنظير القصبات ؛ لذلك ، استخدم أنسجة الرئة من عينات استئصال الفص. يتطلب تحسين عينات أنسجة الرئة اتصالا وثيقا بخدمة علم الأمراض التشريحي. تأكد من أن الأنسجة لها هامش لا يقل عن 3 سم من الورم وأنها الأنسجة الخلوية بدون انتفاخ الرئة الكبير (على النحو الذي يحدده أخصائي علم الأمراض).
- قسم أنسجة الرئة إلى معلق خلوي قبل استخدامه في فحوصات قياس التدفق الخلوي. هضم أنسجة الرئة كيميائيا (على سبيل المثال ، باستخدام الكولاجيناز) أو قم بتقسيمها ميكانيكيا. < / >
ملاحظه: قد يكون التصنيف الميكانيكي للأنسجة مفضلا لأن هذا يرتبط بتلوين أفضل للخلايا على سطح الخلايا (على سبيل المثال ، وضع العلامات CD3 / 4).
- الحصول على عينات استئصال الفص من أخصائي علم الأمراض (عادة ما يتم الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لعلاج سرطان الرئة). قم بتقطيع حوالي 20-40 جم من العينة إلى 3-5 مم3 أقسام. ضعها داخل غرفة معقمة سعة 50 ميكرولتر قبل تجزئتها ميكانيكيا باستخدام أداة توزيع مناسبة.
- بعد تفكيك الأنسجة ، قم بتحلل كريات الدم الحمراء بنسبة 10: 1 (أي 5 مل) من 0.8٪ كلوريد الأمونيوم (150 ملي مولار كلوريد الأمونيوم (NH4Cl) ، و 1 ملي مولار بيكربونات الصوديوم (NaHCO3) ، و 0.1 ملي مولار محلول حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA). < / >
ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام نظام آلي مثل Q-prep.
- أعد تعليق الخلايا في RPMI معقم (سيعتمد الحجم على أرقام الخلايا وبشكل عام 10-20 مل) ، ثم قم بتصفيتها من خلال شبكة نايلون معقمة 100 ميكرومتر. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة باستخدام طريقة استبعاد trypan blue.
< p class = "jove_title" >
3. فحص عدوى NTHi
- إعادة تعليق خلايا الرئة إلى تركيز خلية نهائي يبلغ 4 × 106 خلايا / مل لكل أنبوب (عينات التحكم والمحفزة).
- استخدم تعليقا من 4 × 106-6 × 106 خلايا في 1 مل من RPMI لأنبوب التحكم (السلبي). استخدم نفس الكمية لأنبوب NTHi (يمكن استخدام أي عينة إضافية كعنصر تحكم إيجابي مع المستضد الفائق للمكورات العنقودية E (SEB). إصابة الخلايا الموجودة في أنبوب NTHi بمعدل داخلي يبلغ 100 بكتيريا لكل خلية. قم بفك الغطاء نصف دوران للسماح بنقل الغاز في الأنابيب.
- ضع الخلايا في أنبوب دوار واحتضانها عند 37 درجة مئوية أثناء الدوران عند 12 دورة في الدقيقة.
- لمنع تصدير السيتوكينات خارج الخلية ، أضف حاصرات جولجي (Brefeldin A) إلى معلقات الخلية بعد ساعة واحدة من التحفيز إلى تركيز نهائي يبلغ 10 ميكروغرام / مل. أعد معلقات الخلية لمدة 16-22 ساعة أخرى عند الدوران.
- اغسل معلق الخلية ب 500 ميكرولتر من محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) يحتوي على 1٪ ألبومين مصل بقري (BSA) و 0.01٪ أزيد الصوديوم ،NaN 3.
- أضف الأجسام المضادة لتلوين السيتوكين داخل الخلايا (يتم تحديد اختيار الأجسام المضادة من قبل المحقق). تلطخ معلق الخلية لعلامات سطح خلايا الخلايا الليمفاوية البشرية المحددة (على سبيل المثال ، CD45 ، CD3 ، إلخ) لمدة 1 ساعة. اغسل الخلايا باستخدام PBS ، وقم بإصلاحها ونفاذها.
- قم بإصلاح الخلايا باستخدام 500 ميكرولتر من 1٪ -2٪ بارافورمالدهيد لمدة 1 ساعة.
- عد الخلايا عن طريق مقياس الدم ، ونفخ 106 خلايا مع 100 ميكرولتر من 0.1٪ سابونين لمدة 15 دقيقة ، واحتضان الخلايا بالأجسام المضادة المسماة بالفلورسنت. اغسل الخلايا وقم بتحليلها باستخدام مقياس التدفق الخلوي.
ملاحظه: ستكون كمية الأجسام المضادة ذات العلامات الفلورية محددة لكل سيتوكين. اتبع تعليمات الشركة المصنعة. عادة ، سيتم تلطيخ 106 خلايا في 100 ميكرولتر من المحلول لمدة ساعة واحدة. ستكون معظم الأجسام المضادة التي تم الحصول عليها تجاريا كافية لإجراء 25-100 اختبار.
- احتضان الخلايا بالأجسام المضادة لتلوين السيتوكين داخل الخلايا (على سبيل المثال ، إنترفيرون جاما ، IFN-γ وعامل نخر الورم بيتا ، TNF-α أو الإنترلوكين ، IL-13 ، و IL-17A) لمدة 1 ساعة
ملاحظه: يوصى بتلطيخ علامات السطح أولا ، ثم داخل الخلايا حيث يمكن أن يتسبب التثبيت في حدوث تغيرات توافقية في البروتينات السطحية التي ترتبط بها الأجسام المضادة.
- اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من PBS وأعد تعليقها في 100 ميكرولتر من PBS قبل الحصول على البيانات على مقياس التدفق الخلوي.