تحديد إنتاج ROS بواسطة العدلات عند التفاعل مع الأغشية الحيوية النظيرة

الملخص

المصدر: Rana ، P. S. J. B. ، وآخرون فحوصات موحدة في المختبر لتصور وقياس التفاعلات بين العدلات البشرية والمكورات العنقودية الذهبية الأغشية الحيوية. J. Vis. إكسب. (2022)

في هذا الفيديو ، نوضح مقايسة التلألؤ الكيميائي في المختبر للكشف عن توليد أنواع الأكسجين التفاعلية بواسطة العدلات عند التعرض للغشاء الحيوي البكتيري المضاد.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. قياس ROS الذي تنتجه العدلات

1. أضف 100 ميكرولتر من المصل البشري العادي بنسبة 20٪ (المخفف في HBSS) بالتنقيط إلى الأغشية الحيوية المغسولة واحتضانها عند 37 درجة مئوية في ظل ظروف ثابتة لمدة 30 دقيقة لمعالجة الأغشية الحيوية.
2. استنشق محلول المصل بنسبة 20٪ واغسل الأغشية الحيوية بالتنقيط باستخدام 150 ميكرولتر من HBSS مرة واحدة. استنشق HBSS ، تاركا وراءه آبارا ذات أغشية حيوية opsonized.
   ملاحظه: لتفسير التجربة ، يوصى بأربع مجموعات على الأقل: (أ) العدلات + الأغشية الحيوية ، (ب) العدلات + PMA (التحكم الإيجابي ، انظر جدول المواد) ، (ج) العدلات فقط ، و (د) الأغشية الحيوية فقط.
3. أضف اللومينول (انظر جدول المواد) إلى العدلات المعلقة في HBSS بتركيز 4 × 10⁶ خلايا / مل بحيث يكون تركيز اللومينول النهائي 50 ميكرومتر. هذا الحل جاهز للاستخدام للمجموعتين (A) و (C). أضف 4 × 10⁵ عدلات ممزوجة بالألمنول إلى الآبار ذات الأغشية الحيوية المضادة.
4. في أنبوب منفصل ، قم بإعداد محلول لومينول 50 ميكرومتر في HBSS بدون أي عدلات وإضافته إلى البئر المحتوي على الأغشية الحيوية (المجموعة D).
5. Aliquot 350 ميكرولتر من العدلات الممزوجة مع اللومينول وإضافة فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات (PMA) بتركيز نهائي قدره 500 نانوغرام / مل إلى الخليط. بالنسبة للمجموعة (ب) ، أضف 4 × 10⁵ عدلات من هذا الخليط إلى آبار بدون غشاء حيوي. هذا بمثابة تحكم إيجابي.
   ملاحظه: تركيز PMA المشار إليه في هذه الخطوة مرتفع نسبيا لضمان استجابة انفجار قوية لأن العدلات المحفزة ب PMA هي عنصر تحكم إيجابي. يمكن استخدام PMA بتركيز أقل لتنشيط العدلات ، اعتمادا على التجربة.
6. جهاز الطرد المركزي للوحة عند 270 × جم لمدة 30 ثانية عند 4 درجات مئوية.
7. تأكد من ضبط قارئ اللوحة على 37 درجة مئوية جنبا إلى جنب مع إعداد التلألؤ والقراءة الحركية لمدة 60 دقيقة بفواصل زمنية مدتها 3 دقائق. ضع اللوحة في قارئ اللوحة لقياس إنتاج ROS بواسطة العدلات لمدة 60 دقيقة
   ملاحظه: لهذا الاختبار ، نمت الأغشية الحيوية في صفائح بيضاء تستخدم في فحوصات اللمعان. PMA هو ناهض معروف لاستجابة الانفجار التأكسدي. عند إجراء الدراسات التي تنطوي على PMA ، تأكد من إضافة PMA في الخطوة الأخيرة بينما يكون المحلول الذي يحتوي على العدلات باردا لأن PMA يبدأ على الفور في استجابة الانفجار.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 50 مل أنابيب الطرد المركزي المخروطية الترمو: العلمية 339652 مسحة الكحول دينار بحريني يستخدم لسحب الدم عداد الخلية بال توريد 202 ج ألواح البوليسترين ذات القاع المسطح 96 بئر كوستار 3370 ريال محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) 1x جيبكو 14190-144 محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) 1x كورنينج سيلجرو 21-022-السيرة الذاتية بدون الكالسيوم والمغنيسيوم والفينول الأحمر مقياس الدم خط مشرق لومينول سيغما أ 8511-5 جي الحد الأدنى من الوسائط الأساسية (MEM) Alpha 1x جيبكو 41061-029 مصل بشري عادي تكميلية التكنولوجيا الصحي طبق بتري (100 × 15 مم) VWR هاتف: 25384-342 فوربول 12-ميريستات 13-أسيتات محلول بولي إل ليسين سيغما P4707-50 مل برنامج SoftMax Pro الأجهزة الجزيئية برنامج قارئ Microplate المستخدم للحصول على البيانات سبيكتراماكس i3x الأجهزة الجزيئية قارئ اللوحة الدقيقة