$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
< p class = "jove_title" >
1. تحضير الأغشية الحيوية في المختبر
- احصل على مستعمرات معزولة من المكورات العنقودية الذهبية من مخزون محفوظ بالتبريد باستخدام تقنية صفيحة الخطوط على صفيحة أجار غنية بالمغذيات ، مثل أجار الصويا Tryptic (انظر جدول المواد).
- قم بتغطية الآبار الفردية لصفيحة 96 بئرا ب 100 ميكرولتر من 0.001٪ (حجم / حجم) بولي L-Lysine (PLL) المخفف في H2O معقم واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. اترك الآبار تجف طوال الليل في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظه: يتم تنفيذ جميع خطوات الشفط في البروتوكول باستخدام مصيدة الشفط بمساعدة الفراغ ما لم ينص على خلاف ذلك.
- قم بإعداد مزرعة ليلية عن طريق تلقيح مستعمرة من المكورات العنقودية الذهبية في الحد الأدنى من الوسائط الأساسية ألفا (MEMα) مكملة ب 2٪ جلوكوز واحتضانها عند 37 درجة مئوية ، مع رجها عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 16-18 ساعة.
قم - بتخفيف المزرعة الليلية عن طريق نقل 50 ميكرولتر إلى 5 مل من MEMα الطازج المكمل ب 2٪ جلوكوز واحتضانه عند 37 درجة مئوية ، مع الرج عند 200 دورة في الدقيقة ، حتى منتصف المرحلة اللوغاريتمية ، بشكل عام بين الكثافة البصرية 600 (OD600نانومتر) من 0.5-0.8. استخدم MEMα لتطبيع الثقافة اللوغاريتمية المتوسطة إلى OD600نانومتر من 0.1.
- انقل 150 ميكرولتر من المزرعة الطبيعية إلى كل بئر من صفيحة 96 بئر المعالجة ب PLL. احتضان بشكل ثابت لمدة 18-20 ساعة في غرفة رطبة عند 37 درجة مئوية
ملاحظه: يمكن أيضا زراعة الأغشية الحيوية بتنسيقات أخرى مثل الشرائح ذات القنوات μ (انظر جدول المواد).
- استنشاق المادة الطافية لإزالة الخلايا العوالق. اغسل الكتلة الحيوية المتبقية برفق ب 150 ميكرولتر من محلول الملح المتوازن من هانكس (HBSS) لإزالة الخلايا غير المتصلة. أضف HBSS بالتنقيط لتجنب تعطيل الأغشية الحيوية.
ملاحظه: أثناء شفط المادة الطافية و HBSS أثناء الغسيل ، اترك ما يكفي من السائل (طافي أو HBSS) في الآبار التي تحتوي على الأغشية الحيوية بحيث لا يزال الأغشية الحيوية مغمورا. هذا يمنع تعطيل بنية الأغشية الحيوية عند إضافة HBSS بالتنقيط لغسل الأغشية الحيوية.
- كرر الخطوة 1.6 مرتين أخريين على الأقل لإزالة جميع الخلايا العوالق. في هذه المرحلة ، تكون الأغشية الحيوية جاهزة للتجارب الفورية في المصب
ملاحظه: إذا لم يتم استخدام الأغشية الحيوية في تجارب العدلات ، فيمكن استبدال HBSS بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS). يفضل HBSS على PBS حيث يحتوي HBSS على مكونات ، بما في ذلك الجلوكوز ، توفر الظروف المثلى لتنشيط العدلات.
< p class = "jove_title" >
2. عزل العدلات
ملاحظة: تم عزل العدلات باتباع طريقة منشورة مسبقا مع تغييرات طفيفة. يجمع بروتوكول العزل هذا بين الطرد المركزي المتدرج للكثافة أولا ، يليه ترسيب ديكستران بنسبة 3٪. يغطي هذا القسم فقط بروتوكول عزل العدلات العام ، مع التركيز على التغييرات التي تم إجراؤها على البروتوكول المنشور. علاوة على ذلك ، فإن البروتوكول الموضح أدناه هو أحد الطرق العديدة التي يمكنها عزل العدلات ويمكن استبدالها حسب الحاجة. تشمل الطرق الأخرى لعزل العدلات استخدام وسائط فصل الخلايا أو فصل خلايا الأجسام المضادة المغناطيسية.
- سحب الدم من متبرع بالغ عن طريق بزل الوريد ، وفقا للبروتوكول الموضح في IRB المؤسسي. قبل سحب الدم، تأكد من أن المحقنة تحتوي على كمية كافية من الهيبارين الخالي من المواد الحافظة، بحيث يكون التركيز النهائي للهيبارين 20 وحدة / مل.
- خفف الدم الهباريني ب 3/4 حجم 0.9٪ كلوريد الصوديوم الخالي من السموم الداخلية (انظر جدول المواد) في H2O في درجة حرارة الغرفة.
- لكل 20 مل من عينة الدم المخففة ، تناول 14 مل من وسط تدرج الكثافة المتاح تجاريا (انظر جدول المواد) في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. ضع عينة الدم المخففة بعناية فوق وسط تدرج الكثافة.
- جهاز الطرد المركزي عينة الدم ذات الطبقات عند 400 × جم لمدة 40 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تأكد من أن جهاز الطرد المركزي به كسر بطيء لتجنب إزعاج الطبقة بمجرد اكتمال الطرد المركزي.
ملاحظه: ستحتوي عينة الدم على خمس طبقات تحتوي على خليط من المحلول الملحي والبلازما ، وطبقة خلية أحادية النواة ، ووسط تدرج الكثافة ، والعدلات ، وكريات الدم الحمراء.
- باستخدام ماصة مصلية ، قم بشفط جميع الطبقات فوق العدلات وحبيبات كريات الدم الحمراء ، متبوعا بإعادة تعليق لطيف للحبيبات في 0.9٪ كلوريد الصوديوم الخالي من السموم الداخلية البارد في H2O. لكل بيليه تم إنشاؤه من 20 عينة دم مل, أعد تعليق الحبيبات مرة أخرى إلى 20 مل الحجم الإجمالي. أضف حجم 1: 1 من 3٪ ديكستران (انظر جدول المواد). احتضان الأنبوب في وضع مستقيم لمدة 18-20 دقيقة على الثلج.
ملاحظه: تأكد من أن ديكستران 3٪ مصنوع من 0.9٪ كلوريد الصوديوم الخالي من السموم الداخلية في H2O.
- قم بإزالة 20 مل من الطبقة العليا التي تحتوي على العدلات وبعض كريات الدم الحمراء على أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل وقم بطرده عند 355 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- أعد تعليق الحبيبات برفق في 10 مل من H 2 O البارد والمعقم لمدة 30 ثانية لتحلل كريات الدم الحمراء المتبقية. أضف على الفور 10 مل من محلول ملحي بارد خال من السموم الداخلية 0.9٪ إلى الخليط لاستعادة التوتر. الطرد المركزي المحلول عند 233 × جم لمدة 3 دقائق عند 4 درجات مئوية.
- اسكب المادة الطافية وأعد تعليق الحبيبات التي تحتوي على 95٪ -97٪ عدلات في 1 مل HBSS بارد لكل 20 مل من عينة الدم.
- انقل 10 ميكرولتر من العدلات المعلقة في 90 ميكرولتر من صبغة استبعاد التريبان الزرقاء 0.4٪ وعد الخلايا باستخدام مقياس الدم (انظر جدول المواد).
ملاحظه: الخلايا غير القابلة للحياة ملطخة باللون الأزرق لأن صبغة استبعاد التريبان الزرقاء غير منفذة في الخلايا القابلة للحياة. يوفر هذا البروتوكول >99٪ من صلاحية الخلية.
- أضف HBSS إضافيا بحيث يكون التركيز النهائي للعدلات 4 × 106 خلايا / مل
ملاحظه: في الحالات التي تحتوي على صلاحية خلية بنسبة <99٪ ، لا يزال من الممكن تحقيق التركيز النهائي البالغ 4 × 106 خلايا / مل ؛ ومع ذلك ، فإن الحجم الإجمالي للمحلول الذي يحتوي على 4 × 106 خلايا / مل التي تم الحصول عليها. يمكن تعديل التركيز النهائي للعدلات وفقا للاحتياجات التجريبية للمستخدم. تم تعليق العدلات عند تركيز نهائي 4 × 106 خلايا / مل لجميع التجارب الموضحة أدناه. لحساب التباين من متبرع إلى متبرع ، يوصى بشدة بإجراء جميع التجارب التي تنطوي عليها العدلات مع ثلاثة متبرعين مختلفين على الأقل.
3. تصوير تفاعلات الأغشية الحيوية والعدلات
- قم بإعداد فيلم حيوي باستخدام الخطوات 1.2-1.6. لتسهيل تصوير الأغشية الحيوية ، استخدم سلالة فلورية من المكورات العنقودية الذهبية ، مثل USA300 التي تعبر عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) ، لزيادة سهولة التصوير المجهري.
ملاحظه: تم استخدام شريحة ذات 6 μ قنوات (انظر جدول المواد) بدلا من صفيحة 96 بئرا لتوضيح نموذج الأغشية الحيوية في المختبر (الخطوة 1).
- احتضان 4 × 106 خلايا / مل من العدلات مع 100 ميكرومتر من صبغة CMAC الأزرق (7-أمينو-4-كلورو ميثيل كومارين) (BCD ، انظر جدول المواد) لمدة 30 دقيقة في هزاز عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيدالكربون 2. تأكد من احتضان العينات في الظلام والحد من التعرض للضوء للخطوات المتبقية.
- لغسل BCD الزائد ، قم بعمل عدلات الطرد المركزي عند 270 × جم لمدة 5 دقائق وشفط المادة الطافية. إعادة تعليق العدلات في HBSS الطازجة. في هذه المرحلة ، أضف homodimer ethidium -1 (انظر جدول المواد) إلى العدلات الملطخة ب BCD بتركيز نهائي يبلغ 4 ميكرومتر لمراقبة العدلات والموت البكتيري.
- أضف 150 ميكرولتر من العدلات إلى المكورات العنقودية الذهبية الحيوية التي نمت في شرائح μ ، بحيث تكون نسبة العدلات إلى البكتيريا 1:30 (العدلات: البكتيريا). احتضن الشرائح μ في غرفة مرطبة لمدة 30 دقيقة. يعتمد عدد الخلايا البكتيرية على عدد الخلايا التي تم الحصول عليها من طلاء غشاء حيوي لمدة 18 ساعة.
- قم بتصوير تفاعل العدلات والأغشية الحيوية باستخدام قنوات الفلورسنت المقابلة للأطوال الموجية للإثارة والانبعاث للأصباغ / البروتينات الفلورية.
ملاحظه: بالنسبة للدراسة الحالية ، BCD هو 353/466 نانومتر ، و homodimer -1 هو 528/617 نانومتر ، و GFP هو 395/509 نانومتر. الحد من تعرض العينة لليزر أو الضوء لمنع التبييض الضوئي للعينات.
- قم بتحليل الصور باستخدام برامج أو برامج تحليل الصور المجهرية مثل FIJI / ImageJ و COMSTAT2 و BiofilmQ و BAIT وغيرها الكثير><.
ملاحظه: عند العمل مع البقع ، من المهم مراعاة خصوصية الأصباغ المستخدمة. تعمل بعض البقع على الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة ، بينما يعمل البعض الآخر على واحدة فقط. إذا تم تلطيخ العدلات والأغشية الحيوية بشكل منفصل باستخدام الأصباغ التي يمكن أن تلطخ كلا النوعين من الخلايا ، فتأكد من غسل أي صبغة متبقية قبل الجمع بين العدلات والأغشية الحيوية لمنع التلوين المتصالب.